眾所周知，熒光壽命成像需要脈沖式的激光光源。徠卡首創(chuàng)白激光Lightgate門控技術，白激光（WhiteLight Laser）是從470nm到670nm激發(fā)譜線自由可調(diào)的激光光源，同時又是一個脈沖式的激光光源，其脈沖頻率正好適合于常規(guī)染料的熒光壽命成像。徠卡HyD混合型檢測器具有靈敏度高、背景噪音低、動態(tài)范圍大、讀取速度快等特性。徠卡HyD與白激光整合后，即可實現(xiàn)時間門控（gating）成像，在白激光的兩個脈沖激發(fā)之間，HyD檢測器的時間窗口自由可調(diào)，可從時間維度來避開自發(fā)熒光、激光反射光和雜散光等信號的干擾。

搭載白激光的徠卡TCS SP8 X 共聚焦顯微鏡

擁有 Leica TCS SP8 X 可以調(diào)節(jié)激發(fā)光與熒光染料精確匹配，降低使用激光能量，并且提高細胞活性。激發(fā)和檢測光譜的自由調(diào)節(jié)使采集復雜的激發(fā)-發(fā)射光譜成為可能。有了光譜信息，任何染料都可以實現(xiàn)最少光譜交叉、最少樣品損害的最佳激發(fā)�？赏瑫r使用最多8條激發(fā)譜線。

 

為了檢測Lightgate在熒光成像中去除葉綠體自發(fā)熒光的影響，Kodama Y.使用配備白激光和HyD檢測器的Leica TCS SP8 X對M. polymorpha植株中的熒光標記進行了對比鑒定。Lightgate能很好地去除葉綠素在黃色和綠色波段的自發(fā)熒光干擾，僅需延后0.1ns即可在綠色波段去除絕大部分自發(fā)熒光的串擾。

Lightgate能去除葉綠素在黃色和綠色波段的自發(fā)熒光干擾

Lightgate檢測起始時間對去除自發(fā)熒光程度的影響。僅需延后0.1ns開始門控檢測，即可去除絕大部分自發(fā)熒光信號。

由于總的檢測時間窗口縮小，打開Lightgate時間門控之后，人工標記熒光的亮度會稍微有所下降，但是下降幅度很小。由于使用了高靈敏度的HyD檢測器，Lightgate門控導致的亮度下降對正常成像幾乎完全沒有影響。

打開Lightgate時間門控對在根細胞中Citrine黃色熒光信號的影響

自發(fā)熒光的干擾成為植物學成像的一大瓶頸，使得對生理狀態(tài)下的組織和細胞內(nèi)的物質追蹤等應用變得異常困難。在各種去除自發(fā)熒光的各種方法中，徠卡白激光的Lightgate時間門控技術是目前最快捷而有效的一種方法，在去除自發(fā)熒光和雜散光的同時，又能保存下絕大部分真實的熒光信號，同時可應用于z-stack、時間序列等各種成像方式中，使得在植株水平進行多色熒光多維成像變得更加輕松自如。

本文中圖1-圖5中使用的擬南芥（Arabidopsis thalinana）材料為綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）定位在線粒體β-ATPase亞基上的43A9株系14天幼苗，材料由中山大學生命科學學院姚楠實驗室提供，特此感謝！