實(shí)驗(yàn)材料：

1.    材料來源：人眼、兔眼或者豬眼等；

2.    清洗液：不含Ca²⁺和Mg²⁺的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；

3.    特殊取材器械：眼球托與7-0尼龍線。以滅菌的白色橡膠反口膠塞作為眼球托；

4.    消毒液：200IU/ml的慶大霉素生理鹽水；

5.    消化液：0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液；

6.    培養(yǎng)液：為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；

7.    培養(yǎng)器皿：培養(yǎng)瓶、24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿若干；

 

實(shí)驗(yàn)方法：

1.    摘取眼球，用200IU/ml的慶大霉素生理鹽水浸泡消毒5min。沿鋸齒緣后2—3mm處環(huán)形剪開眼球前段，去除角膜、晶狀體以及玻璃體。分離去掉視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層。將眼球后段制成眼杯；

2.    將眼杯置于眼球托（可以洗凈消毒過的鹽水瓶膠塞替代）上，取持針器用7-0尼龍線在4個(gè)對(duì)稱方向上，把眼杯縫合固定在眼球托的壁緣上；

3.    用毛細(xì)吸管輕輕從眼杯中吸出視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層。以PBS液漂洗眼杯2次，吸干；

4.    加入0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液，置于無菌的燒杯中。于37℃恒溫箱中消化30min；

5.    吸去消化液。用PBS液稍洗。加入有血清培養(yǎng)液終止消化酶的作用，并用毛細(xì)吸管輕輕吹打眼杯內(nèi)壁，以使視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞脫落；

6.    收集眼杯內(nèi)的細(xì)胞懸液，離心（800r/min）8min；

7.    棄上清液，將沉淀的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞重新用培養(yǎng)液懸浮。計(jì)數(shù)；

8.    以8×104—10×104個(gè)/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中；

9.    送人培養(yǎng)箱中，按常規(guī)方法培養(yǎng)，每周換液2次；

10.  也可直接用機(jī)械分離植塊法：用無齒鑷撕下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層，經(jīng)PBS漂洗后，將其剪成1.5mm×1.5mm大小的組織塊，直接接種于24孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)；