不連續(xù)Nycodenz梯度溶液中原代細(xì)胞溶酶體的分離

試劑和器材： 
1.勻漿介質(zhì)：0.25mol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4；
2.Nycoprep^TM Universal；
3.磷酸緩沖液pH7.4（50mmol/L）
4.Nycoprep^TM Universal稀釋劑：6mmol/L乙二胺四乙酸、60mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4；
5.Nycodenz工作溶液（500g/L）：將5體積NycoprepTM Universal和1體積NycoprepTM Universal稀釋劑混合；
6.按要求向溶液中加入蛋白酶抑制劑；
7.線粒體組分；
8.超速離心機(jī)，帶有配置約38ml容量離心管的吊桶式轉(zhuǎn)子（也可用較小的17ml或13ml離心管）；
9.10ml規(guī)格注射器（內(nèi)徑大約0.8mm），帶金屬套管針；

實(shí)驗(yàn)方法：
所有操作在0—4℃下進(jìn)行。
1.用勻漿介質(zhì)對(duì)Nycodenz工作溶液進(jìn)行稀釋來產(chǎn)生Nycodenz濃度分別為300g/L、260g/L、240g/L和190g/L的梯度溶液，將這些溶液保持在0—4℃；
2.在勻漿介質(zhì)（4—10ml）中重懸沖洗過的線粒體沉淀，再與2倍體積Nycodenz工作溶液混合；
3.對(duì)于36—38ml的小管，在每個(gè)小管中用帶金屬套管針的注射器加8ml 190g/L Nycodenz于底層，從240g/L、260g/L和300g/L的Nycodenz各取7ml，再加入8—9ml線粒體沉淀混懸液；
4.在95000g下離心2h，然后從190g/L與240g/L Nycodenz界面上收集溶酶體或者在進(jìn)行標(biāo)記分析之前，分級(jí)收集全部梯度組分；