腫瘤學(xué)研究之——評價細(xì)胞遷移的高通量成像檢測法

    在研究諸如轉(zhuǎn)移性腫瘤、炎癥和慢性疾病中，觀察細(xì)胞的遷移是一個很重要的方法。檢測細(xì)胞遷移的方法有助于更清楚的了解疾病的機(jī)制，對于藥物和治療效果的評判也是極其重要的。我們介紹一種新的方法，即結(jié)合MD ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)和Oris 細(xì)胞遷移檢測板，用以檢測細(xì)胞的遷移。

    Oris細(xì)胞遷移檢測板是一個96孔板形式的耗材，硅膠塊能夠封閉住的中心區(qū)域，使中間區(qū)域無法鋪種細(xì)胞。當(dāng)硅膠塊移除后，周圍細(xì)胞遷移進(jìn)入中心區(qū)域，此時可以使用活細(xì)胞試劑，如Calcein-AM進(jìn)行熒光標(biāo)記，或?qū)⒓?xì)胞固定后標(biāo)記細(xì)胞核進(jìn)行檢測分析。

    使用ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)能夠進(jìn)行整孔成像，因此能夠高速高效的獲取孔內(nèi)遷移區(qū)域的圖像。

介紹

    Oris 細(xì)胞遷移板使用硅膠塊封閉96孔板每個孔的中心區(qū)域，使中心區(qū)域無法鋪種細(xì)胞，從而在孔中心獲得一個直徑2mm的環(huán)形檢測區(qū)域，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遷移，周圍的細(xì)胞會遷移進(jìn)入中心監(jiān)測區(qū)域。Oris細(xì)胞遷移板提供多種細(xì)胞外基質(zhì)，如I型膠原和纖維粘連蛋白，鋪涂于96孔板，用于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。我們采用了HT-1080和MDA-MB-231細(xì)胞在鋪有三種不用細(xì)胞外基質(zhì)的Oris板上研究不同水平MEK抑制劑U0126對細(xì)胞遷移的作用。該實(shí)驗(yàn)中，我們可以看到ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)能夠快速方便的獲得每個孔內(nèi)包含監(jiān)測區(qū)域的圖像。軟件系統(tǒng)能夠自動計(jì)算孔中心監(jiān)測區(qū)域遷移細(xì)胞所占據(jù)的面積，從而快速獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

材料

●Oris細(xì)胞遷移檢測板

●HT-1080纖維肉瘤細(xì)胞

●MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞

●HT-1080細(xì)胞培養(yǎng)液：含有10%高溫滅火FBS的EMEM，抗生素，碳酸氫鈉，丙酮酸鈉。

●PBS

●8%戊二醛

●Triton X-100

●DMSO

●MEK抑制劑U0126

●PI

●ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)

實(shí)驗(yàn)方法

1. 將HT-1080和MDA-MB-231細(xì)胞以30000細(xì)胞/孔的密度種植于三種細(xì)胞外基質(zhì)包被的Oris細(xì)胞遷移板中（圖1）。在37度下培養(yǎng)6小時，使細(xì)胞牢固貼壁。

2. 6小時后，除對照孔外，移除Oris板上的封閉硅膠（1,5,9列）

3. 在37度下，孔內(nèi)加入0.1% DMSO或MEK抑制劑U0126，孵育16小時，使細(xì)胞發(fā)生自由遷移。

4. 以0.25%戊二醛固定細(xì)胞，以0.1%Triton X-100破膜。

5. PBS沖洗，1ug/mL PI室溫下孵育30分鐘。無需二次沖洗。

6. 樣品放入ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)，在2X物鏡下和標(biāo)準(zhǔn)的Cy3濾色片組進(jìn)行細(xì)胞成像。在2X鏡下，ImageXpress Micro系統(tǒng)能夠進(jìn)行整孔成像，可以一次獲得整個孔內(nèi)細(xì)胞區(qū)域和檢測區(qū)域的圖像。

圖1. 包被有三種不同基質(zhì)的Oris細(xì)胞遷移板。A-D行種以HT-1080細(xì)胞，E-H行種以MDA-MB-231細(xì)胞。

結(jié)果

    ImageXpress Micro系統(tǒng)獲得孔內(nèi)圖像，采用優(yōu)化的分析系統(tǒng)辨認(rèn)熒光細(xì)胞并在特定區(qū)域（ROI）辨認(rèn)背景。通過對中心檢測區(qū)域內(nèi)細(xì)胞的識別，可以分析出遷移進(jìn)入該區(qū)域的細(xì)胞的數(shù)量。 ImageXpress Micro系統(tǒng)在5分鐘內(nèi)自動獲得全部圖像，圖像自動保存入MDCStor數(shù)據(jù)庫內(nèi)，當(dāng)需要時，可以進(jìn)行所有圖像的自動分析。

圖2. ImageXpress Micro系統(tǒng)2x鏡頭下獲得的孔內(nèi)圖像。右圖顯示環(huán)狀檢測區(qū)域。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HT-1080和MDA-MB-231細(xì)胞在膠原包被的孔內(nèi)的遷移數(shù)量要高于未包被或纖維粘連蛋白包被�？梢钥吹剑�HT-1080細(xì)胞遷移占據(jù)了較MDA-MB-231細(xì)胞更多的中間ROI區(qū)域。

圖3. 結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞在膠原包被表面較未包被或纖維粘連蛋白包被表面遷移更加明顯。

    MEK抑制劑U0126對不同表面包被孔內(nèi)細(xì)胞都表現(xiàn)出了劑量依賴性抑制作用。但是在未包被和纖維粘連蛋白包被孔內(nèi)的抑制作用更加復(fù)雜。

    同時，ImageXpress Micro在檢測過程中能夠?qū)�檢測區(qū)域ROI外細(xì)胞排除而只檢測ROI內(nèi)遷移細(xì)胞，因此檢測窗口大，檢測靈敏度高。

圖4. 圖表顯示，相對于對照組抑制劑的抑制百分比。U0126對于膠原表面包被孔內(nèi)細(xì)胞的抑制作用弱于其他表面包被孔內(nèi)的細(xì)胞。

總結(jié)：

●HT-1080和MDA-MB-231細(xì)胞對MEK抑制劑U0126表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用。

●如結(jié)果顯示，ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)適合于進(jìn)行細(xì)胞遷移的研究，由于可以將ROI區(qū)域外細(xì)胞排除在外，因此檢測窗口大，檢測靈敏度高。

●Oris細(xì)胞遷移板使用方便，易于操作，可用于活細(xì)胞或固定細(xì)胞（活細(xì)胞數(shù)據(jù)未展示）