在RPLC模式下，可再現(xiàn)保留所需的典型柱平衡約為10倍柱體積。

圖14中可清楚反映這一點(diǎn)
但是，對于HILIC分離則不同。通常，HILIC色譜柱的平衡時(shí)間比RPLC色譜柱的更長。

這是該技術(shù)的一個(gè)特點(diǎn)，也是可再現(xiàn)保留所必需的。
在固定相粒子周圍建立和形成穩(wěn)定的水合層對可再現(xiàn)HILIC色譜法很重要（HILIC色譜法的重現(xiàn)性至關(guān)重要）。

所花費(fèi)的時(shí)間也因相位（固定相）特性、洗脫劑和分析物而各有不同，因此取決于具體應(yīng)用。

下面的指導(dǎo)原則可用作近似法（近似的參考）。

重要的是：在HILIC方法開發(fā)中，平衡將作為各項(xiàng)分離的一個(gè)參數(shù)進(jìn)行研究（對于每一個(gè)成熟的分離方法，在HILIC方法開發(fā)時(shí)，平衡時(shí)間都將作為一個(gè)參數(shù)進(jìn)行研究）。
對于全新的未使用色譜柱，建議使用60-80倍柱體積，以在最初建立HILIC所需的水層。

圖14
RPLC和HILIC模式中達(dá)到全新未使用色譜柱所需的柱體積數(shù)的對比

一旦建立水層，可實(shí)現(xiàn)可再現(xiàn)（重現(xiàn)性）和一致的保留和色譜法（可實(shí)現(xiàn)色譜方法的重現(xiàn)性，一致的保留時(shí)間）。
運(yùn)行完成后，應(yīng)清洗色譜柱并根據(jù)第9節(jié)中相關(guān)指導(dǎo)說明儲(chǔ)藏。

對于色譜柱第二次以及之后的每次運(yùn)行，建議只采用20倍柱體積，以達(dá)到穩(wěn)定的保留次數(shù)（時(shí)間），見圖15。

圖15
HILIC模式中第二次及隨后每次分析達(dá)到平衡所需的柱體積數(shù)對比
色譜柱：ACE 5 HILIC-A,
100 x 3.0 mm
流動(dòng)相：10 mM甲酸銨，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：0.43 mL/min
溫度：25 °C
檢測：UV, 214 nm
樣本：
1) 2’-脫氧鳥苷
2) 4-羥基苯甲酸
3) 沙丁胺醇

梯度HILIC平衡

同時(shí)，ACE HILIC相也可以使用可再現(xiàn)梯度HILIC法（ACEHILIC色譜柱也可重現(xiàn)HILIC方法的梯度洗脫）。

經(jīng)確定，兩次進(jìn)樣之間大約需要10倍柱體積。兩次進(jìn)樣之間的平衡時(shí)間低于新色譜柱所需的時(shí)間，因?yàn)橹恍枰�重新建立起始條件。

新色譜柱需要平衡，以在固定相顆粒上形成水合層（而新色譜柱需要長時(shí)間平衡，是因?yàn)樾枰�在固定相顆粒上形成水合層）。

圖16
顯示了兩次進(jìn)樣之間使用20倍柱體積平衡情況下，兩次連續(xù)進(jìn)樣梯度HILIC分析的極佳保留再現(xiàn)性。