注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：
LPS又稱(chēng)甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油（或者甘油二酯和單酯）。LPS廣泛的存在于各種生物中。血清中LPS的異常增高常見(jiàn)于胰腺炎和胰腺癌。 

測(cè)定原理：
LPS催化油酯水解成脂肪酸，利用銅皂法測(cè)定脂肪酸生成速率，即可計(jì)算LPS活性。

自備儀器和用品：
研缽、臺(tái)式離心機(jī)、震蕩混勻器、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、甲苯100mL、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：
試劑一：液體90mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體14mL×1瓶，4℃保存。每次使用前用震蕩混勻器劇烈震蕩20min。
試劑三：甲苯100mL×1瓶，4℃保存（自備）。
試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體10μL×1瓶，10 µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃保存。臨用前加入3.168 mL甲苯，充分溶解。

粗酶液提取：

• 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。
• 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后12000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
• 血清等液體: 直接檢測(cè)。

LPS測(cè)定操作：

• 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到710 nm，蒸餾水調(diào)零。
• 試劑一和試劑二置于37℃水浴預(yù)熱30min以上。
• 在5mL EP管中依次加入下列試劑

 

試劑名稱(chēng)（μL）	空白管	測(cè)定管
蒸餾水	375
樣本		125
試劑一	750	750
試劑二		250

試劑三

2000

2000

試劑名稱(chēng)（μL）	空白管	測(cè)定管	標(biāo)準(zhǔn)管
上清液	1200	1200

標(biāo)準(zhǔn)品			1200
試劑四	300	300	300

LPS活性計(jì)算公式：
1. 組織、細(xì)菌或細(xì)胞LPS活性
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個(gè)酶活單位。
LPS (μmol/min/mg prot) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]×V反總÷（Cpr×V樣）÷T=16×[(A測(cè)定管－A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個(gè)酶活單位。
LPS (μmol/min/g 鮮重) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T=16×[(A測(cè)定管－A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]÷W
（3）按照細(xì)菌或者細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個(gè)酶活單位。
LPS (μmol /min/10⁴cell) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]×V反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=16×[(A測(cè)定管－A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]÷細(xì)胞數(shù)量
2. 血清等液體LPS活性
活性單位定義：37℃中每毫升血清每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個(gè)酶活單位。
LPS (μmol /min/mL) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]×V反總÷V樣÷T
=16×[(A測(cè)定管－A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]
C標(biāo)準(zhǔn)品：10 µmol/mL；V反總：反應(yīng)總體積，2mL；V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，0.125mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W：樣本質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間，10 min。