前兩期，我們分享了海藻糖用于人源少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）和脂肪來源干細(xì)胞凍存的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)向凍存液中添加一定量海藻糖或使用海藻糖+甘油復(fù)合型凍存保護(hù)劑，可以提升干細(xì)胞長期凍存后的復(fù)蘇活率，從而有助于后續(xù)將干細(xì)胞用于疾病治療或創(chuàng)面修復(fù)等臨床應(yīng)用。

本期，我們以小鼠睪丸生精細(xì)胞凍存為例，來探究一下海藻糖在輔助生殖領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

不同凍存保護(hù)劑對(duì)未性成熟小鼠睪丸生精細(xì)胞凍存的影響

1. 睪丸生精細(xì)胞凍存背景

近些年，隨著輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的患者生育后代成為了可能。在此過程中，生殖相關(guān)細(xì)胞的長期凍存成為了影響成功率的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)之一。

例如，對(duì)于青春期前男性腫瘤患者，性腺毒性治療可能會(huì)導(dǎo)致生育能力永久性喪失，睪丸組織或細(xì)胞低溫長期凍存是保存其生育力的重要手段。

然而對(duì)于全身性腫瘤患者，睪丸組織冷凍及復(fù)蘇后自體移植會(huì)帶來再次引入癌細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。考慮到睪丸細(xì)胞懸浮液可以進(jìn)行分選清除癌細(xì)胞，而精原干細(xì)胞（SSC）可以在體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化成圓形精子細(xì)胞，通過圓形精子細(xì)胞注射獲得后代。

因此，對(duì)于青春期前男性腫瘤患者，睪丸生精細(xì)胞的長期凍存是保存生育能力的重要途徑之一，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

來自鄭州大學(xué)人民醫(yī)院的張嘯龍等研究人員，采用兩周齡小鼠模擬人在青春期前未性成熟的睪丸發(fā)育狀態(tài)，采用不同凍存方案對(duì)小鼠睪丸生精細(xì)胞進(jìn)行低溫凍存，探究最佳冷凍方案。

2. 不同凍存保護(hù)劑效果比較

該研究根據(jù)凍存液組分不同，分為以下5組：

組別

采用兩步酶解法制備小鼠睪丸生精細(xì)胞懸液，分裝，分別加入5組凍存保護(hù)劑并轉(zhuǎn)移至凍存管中。將凍存管進(jìn)行程序化冷凍，2個(gè)月后從液氮中取出，復(fù)蘇，檢測(cè)細(xì)胞活率、凋亡率、線粒體膜電位等。

3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

①凍存前后細(xì)胞活率及復(fù)蘇率

與凍存前比較，5組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凍存復(fù)蘇后活率均有所下降。其中E組細(xì)胞活率及復(fù)蘇率顯著高于其余4組。

②凍存后細(xì)胞恢復(fù)情況

以每組4mg睪丸組織解離凍存后實(shí)際回收的活細(xì)胞數(shù)，對(duì)睪丸細(xì)胞凍存復(fù)蘇后進(jìn)行定量計(jì)算。結(jié)果顯示E組細(xì)胞恢復(fù)數(shù)量顯著高于其他4組。

③細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均顯著增加。5組實(shí)驗(yàn)組中，E組細(xì)胞凋亡率顯著低于其余4組。

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④線粒體膜電位

與對(duì)照組相比，凍存復(fù)蘇后5組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞線粒體膜電位均顯著下降，其中E組下降程度最低，顯著低于其余4組。

4. 討論

冷凍保護(hù)劑可分為滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑，非滲透性保護(hù)劑中，最常用的是蔗糖和海藻糖。此前有研究顯示，向冷凍保護(hù)劑中添加蔗糖或海藻糖，可顯著提高恒河猴或小鼠的睪丸細(xì)胞復(fù)蘇活率。

該研究結(jié)果顯示，冷凍保護(hù)劑中添加0.1mol/L蔗糖或0.1mol/L海藻糖對(duì)細(xì)胞低溫冷凍均具有一定的保護(hù)作用，而同時(shí)添加0.1mol/L蔗糖和0.1mol/L海藻糖可顯著提高小鼠睪丸生精細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后的活率，降低細(xì)胞凋亡率，并降低低溫凍存對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的損傷。

但較高的DMSO濃度（15%）產(chǎn)生的細(xì)胞毒性會(huì)部分抵消蔗糖和海藻糖的冷凍保護(hù)作用。