（超）多重PCR的技術(shù)門(mén)檻到底高不高，做過(guò)PCR的人都明白，做單重PCR都會(huì)有二聚體和非特異擴(kuò)增的存在，更何況一管內(nèi)擴(kuò)增幾千重，那二聚體和非特異擴(kuò)增簡(jiǎn)直就是災(zāi)難級(jí)別的，根本看不到目標(biāo)條帶，二聚體完全掩蓋住了目標(biāo)條帶擴(kuò)增。目前，突破多重PCR技術(shù)壁壘，基本可以歸納為2個(gè)方向：生信設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)改造。

一、生信算法

很多科研團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了很多多重PCR引物的算法和軟件， MultiPLX計(jì)算現(xiàn)有PCR引物的相容性評(píng)分，并對(duì)多重PCR引物進(jìn)行分組；Oli2go將多個(gè)序列作為輸入，為所有序列設(shè)計(jì)多重引物和探針，其特異性檢查不僅限于單個(gè)物種，而且可以在多種物種上進(jìn)行；MPprimer和PrimerStation設(shè)計(jì)多重引物組，其擴(kuò)增子的大小不同，以便通過(guò)電泳分離；MCMC-ODPR采用Markov chain Monte Carlo優(yōu)化方法，圍繞單核苷酸多態(tài)性設(shè)計(jì)多重簡(jiǎn)并引物，注重引物的可重復(fù)使用性，以降低成本。

引人注目的應(yīng)該是，Nature Communications上的，一種二聚體似然估計(jì)的模擬退火設(shè)計(jì)（SADDLE）的算法。在大型擴(kuò)增子法測(cè)序panel中實(shí)現(xiàn)了超低的引物二聚體水平，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步設(shè)計(jì)了384-plex panel（768 對(duì)引物）進(jìn)行驗(yàn)證，優(yōu)化流程耗時(shí)60分鐘，而最終實(shí)驗(yàn)觀察到的引物二聚體比例僅為1%。高通量PCR儀二、實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的邏輯其實(shí)很簡(jiǎn)單，多重PCR就好比多個(gè)魚(yú)鉤去釣魚(yú)，現(xiàn)在問(wèn)題出在魚(yú)鉤太多，那就對(duì)魚(yú)鉤進(jìn)行優(yōu)化，上面說(shuō)的生信分析，就是利用生信算法，挑選整個(gè)體系中最合適的魚(yú)鉤，讓魚(yú)鉤彼此之間不會(huì)有干擾。而實(shí)驗(yàn)方法，則是改造魚(yú)鉤，將魚(yú)鉤改造成不容易互相干擾的樣式。一些創(chuàng)新的多重PCR技術(shù)方法，采用Ω引物結(jié)構(gòu)，提高引物的特異性，減少非特異性擴(kuò)增。

或者將魚(yú)鉤封住，等到需要它的時(shí)候，再讓它發(fā)揮功能，比如：IDT的rhAmp PCR技術(shù)，

使用帶RNA堿基的rhAmp引物對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增

，RNase H2 對(duì) DNA:RNA 雜合雙鏈內(nèi)的 RNA 堿基進(jìn)行靶向切割

解除，3' 端封閉序列從而活化rhAmp 引物

。RNase H2 具有高度特異性，只切割完全互補(bǔ)匹配的RNA堿基，因此減少了非特異性雜交和引物二聚體。

其中，最經(jīng)典去除二聚體的方法，當(dāng)然是引物中引入U(xiǎn)堿基，擴(kuò)增后，使用UDG等混酶，消化多余的引物，防止引物二聚體。還有其他很多的技術(shù)方法，大部分都是在引物上的修飾或改造。

上面說(shuō)的技術(shù)方法，能夠在一定程度上解決引物二聚體的干擾問(wèn)題。但是很難徹底解決這個(gè)問(wèn)題。因此多重PCR，依然存在重?cái)?shù)限制，達(dá)到1000重算是很不錯(cuò)了。

在技術(shù)應(yīng)用上，利用多重PCR進(jìn)行病原菌檢測(cè)，應(yīng)該是技術(shù)門(mén)檻最高的，因?yàn)椴≡�菌的含量在患者的組織或體液中有的很低，而且有人源基因組的擴(kuò)增干擾問(wèn)題（背景DNA太多），對(duì)于多重?cái)U(kuò)增帶來(lái)了很大的問(wèn)題。引物二聚體的問(wèn)題更是突出。但是多重PCR技術(shù)的便捷和低價(jià)，是這個(gè)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，因此如果能夠真的將多重PCR技術(shù)的諸多問(wèn)題解決，在許多方面，可以大規(guī)模低成本的使用，如分子遺傳育種、突變識(shí)別等方面都可以發(fā)揮巨大價(jià)值。