一，動(dòng)態(tài)顯色法原理

革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素催化了LAL中酶原的活化 。初始活化速率由內(nèi)毒素的濃度決定�；罨�后的酶催化了無(wú)色底物 Ac-lle-Glu-Ala-Arg-pNA釋放出pNA。在整個(gè)孵育過(guò)程中，用光度法連續(xù)測(cè)量405nm處的游離pNA。通過(guò)將其反應(yīng)時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較，計(jì)算出樣品中的內(nèi)毒素濃度。

酶原 內(nèi)毒素 凝固酶

底物 + H2O 酶肽 肽 + pNA
 

二，動(dòng)態(tài)濁度法原理

濁度法是通過(guò)檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化來(lái)檢測(cè)內(nèi)毒素含量的鱟試驗(yàn)法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度或透光率所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。隨著凝膠的形成，反應(yīng)液吸光值的增加、OD值增加速率和內(nèi)毒素的濃度呈正相關(guān)。
 

三，光度法檢測(cè)所需主要設(shè)備、材料

試劑

– 鱟試劑（LAL）（Kinetic-QCL™ 或 PYROGENT™-5000 試劑）

– 內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 (CSE)

– LAL溶解緩沖液（用于PYROGENT™-5000動(dòng)態(tài)濁度法LAL 試驗(yàn)）

– LAL 試劑檢查用水（即LRW）(# W50-640, W50-100, W50-500)

器具

– 玻璃稀釋管(# N207)

– 獨(dú)立包裝的血清吸管（選購(gòu)）

– 標(biāo)簽

– 96-微孔板 (# 25-340)

– 試劑槽(# 00190035)

請(qǐng)使用經(jīng)內(nèi)毒素試驗(yàn)驗(yàn)證合格的無(wú)熱原器具。

設(shè)備和軟件

– 八道移液器

– 光吸收酶標(biāo)儀

– WinKQCL™軟件

– 移液器

– 計(jì)時(shí)器

– 漩渦混合器

四，操作步驟

本指南分步描述了如何進(jìn)行傳統(tǒng)動(dòng)態(tài)法鱟試劑（以下簡(jiǎn)稱(chēng)LAL）試驗(yàn)。試驗(yàn)開(kāi)始前，先使試劑瓶溫度與室溫相同。還應(yīng)打開(kāi)孵育酶標(biāo)儀，并在WinKQCL軟件中創(chuàng)建微孔板模板。

五，注意事項(xiàng)

– 使用配套的LAL和 CSE 試劑

– 建議勿使用塑膠管稀釋內(nèi)毒素

– 遵循所有關(guān)于內(nèi)毒素漩渦震蕩次數(shù)的建議

– 使用經(jīng)內(nèi)毒素試驗(yàn)驗(yàn)證合格的無(wú)熱原器具

– 使用前，先使試劑溫度與室溫保持相同

– 不要對(duì)LAL進(jìn)行漩渦震蕩

– 將試劑放入96-微孔板的孔中時(shí)，避免產(chǎn)生氣泡

– 不要污染樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、LRW 和器具

– 應(yīng)正確安裝、驗(yàn)證并維護(hù)設(shè)備儀器