基于CERO生物反應(yīng)器的人類干細(xì)胞規(guī)模懸浮擴(kuò)增方法介紹

瀏覽次數(shù)：817　發(fā)布日期：2025-8-11　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

本文介紹了一種可重復(fù)且多功能的人類多能干細(xì)胞（hPSC）動態(tài)懸浮擴(kuò)增系統(tǒng)，通過OLS CERO臺式細(xì)胞生物反應(yīng)器，將 hPSC 以未分化聚集物形式培養(yǎng)。研究表明，在mTeSR 或 E8 培養(yǎng)基中進(jìn)行 10 代長期擴(kuò)增后，hPSC 仍保持正常核型、三胚層分化潛能及多能性標(biāo)志物的高表達(dá)。該系統(tǒng)支持低至0.3×10⁵ cells/mL 的接種密度，提供了簡化、經(jīng)濟(jì)且省時的中規(guī)模 hPSC 制備方法，對推進(jìn)基于 hiPSC 的醫(yī)學(xué)研究中的細(xì)胞制造具有重要意義。

CERO 3D細(xì)胞（類器官)生物反應(yīng)器

1. 研究背景
隨著人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）在疾病建模、藥物篩選等領(lǐng)域的應(yīng)用，亟需標(biāo)準(zhǔn)化、自動化、低成本的 hPSC 擴(kuò)增技術(shù)。

現(xiàn)有生物反應(yīng)器多適用于大規(guī)模生產(chǎn)，存在體積大、需大量培養(yǎng)基、操作復(fù)雜、依賴專業(yè)人員等問題，難以滿足多患者特異性 hiPSC 系的平行小規(guī)模擴(kuò)增需求。
因此，研究旨在開發(fā)一種適用于中規(guī)模、平行化、簡單高效的 hPSC 懸浮擴(kuò)增系統(tǒng)。

2. 材料與方法
細(xì)胞類型：
人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）：iLB-C-31f-r1（源自真皮成纖維細(xì)胞）
人胚胎干細(xì)胞（hESC）：H9

培養(yǎng)系統(tǒng)：
OLS CERO臺式細(xì)胞生物反應(yīng)器：含 4 個 50mL 一次性培養(yǎng)容器，具備溫度控制（37℃）、CO₂濃度控制、旋轉(zhuǎn)攪拌（維持聚集物懸浮及營養(yǎng)供應(yīng)），參數(shù)可通過觸摸屏設(shè)置并保存。

培養(yǎng)方案：
接種：從 2D 培養(yǎng)收獲單細(xì)胞，以 0.33-2.0×10⁵ cells/mL 密度接種至 10mL 培養(yǎng)基（含 10μM ROCK 抑制劑）。
培養(yǎng)：每日添加 5mL 培養(yǎng)基（mTeSR 培養(yǎng) 4 天，E8 需縮短周期），通過調(diào)整旋轉(zhuǎn)速度控制聚集物大小。
傳代：聚集物沉降后離心，經(jīng) Accutase 處理為單細(xì)胞，重新接種。

檢測方法：
多能性驗證：免疫熒光（檢測 Oct-4、Nanog、Tra1-60 等）、流式細(xì)胞術(shù)（Tra1-60 表達(dá)）。
分化潛能：三胚層分化實驗（檢測 AFP、SMA、TUBB3 等標(biāo)志物）、TaqMan® hPSC Scorecard™ Panel。
基因組穩(wěn)定性：SNP 芯片分析。
代謝分析：葡萄糖和乳酸濃度檢測（YSI 2700 分析儀）。

3. 研究結(jié)果
3D 懸浮培養(yǎng)體系的建立：
在 mTeSR 中，以 7.5×10⁴ cells/mL 接種時，4 天內(nèi)擴(kuò)增倍數(shù)達(dá) 4.9±2.1，Tra1-60 表達(dá) > 90%。
形成均一圓形聚集物，平均直徑 140±36μm（mTeSR）、138±24μm（E8）。

長期擴(kuò)增能力（10 代）：
擴(kuò)增率：hESC 為 5.42±2.87，hiPSC 為 5.09±3.20（mTeSR）；E8 中 hESC 擴(kuò)增率 7.1±3.4，與 mTeSR 無顯著差異。
多能性維持：持續(xù)高表達(dá) Tra1-60（>90%）、Oct-4、Nanog，無分化標(biāo)志物表達(dá)。
基因組與分化潛能：SNP 分析證實核型穩(wěn)定，三胚層分化實驗及 Scorecard 檢測顯示分化能力未受影響。

mTeSR 與 E8 培養(yǎng)基對比（如下表）：

指標(biāo)	mTeSR 培養(yǎng)基	E8 培養(yǎng)基
最大擴(kuò)增倍數(shù)	低接種密度下可達(dá) 20 倍	低接種密度下可達(dá) 14 倍
Tra1-60 表達(dá)高峰	第 4 天（>90%）	第 3 天（88.4±1.7%），第 4 天降至 61.8±29.3%
代謝特點	第 4 天起葡萄糖驟降、乳酸驟升	第 3 天起葡萄糖驟降、乳酸驟升
培養(yǎng)周期	4 天	需縮短（建議 3 天）
聚集物大小	140±36μm	138±24μm

2D 與 3D 培養(yǎng)轉(zhuǎn)換：hPSC 在 2D 與 3D 培養(yǎng)間切換后，仍保持典型克隆形態(tài)及高表達(dá)多能性標(biāo)志物（Tra1-60>90%）。

4. 討論與意義
該系統(tǒng)解決了現(xiàn)有技術(shù)的痛點，實現(xiàn)了 hPSC 的中規(guī)模、平行化、低成本擴(kuò)增，操作簡單且無需專業(yè)培訓(xùn)。
支持從低接種密度起始，且能長期維持 hPSC 的多能性和基因組穩(wěn)定性，適用于 hiPSC 生物銀行建設(shè)和疾病建模。
兼容 mTeSR（ undefined ）和 E8（化學(xué)定義、無血清）兩種培養(yǎng)基，其中 E8 的應(yīng)用為臨床級細(xì)胞生產(chǎn)提供了可能。
2D 與 3D 培養(yǎng)的無縫轉(zhuǎn)換便于整合下游 2D 分化實驗，拓展了其在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用中的實用性。

關(guān)鍵問題：
該 hPSC 懸浮擴(kuò)增系統(tǒng)相比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法有哪些核心優(yōu)勢？
答：核心優(yōu)勢包括：①操作簡化：使用 OLS CERO臺式反應(yīng)器，無需復(fù)雜設(shè)備或?qū)I(yè)培訓(xùn)，支持 4 個樣本平行培養(yǎng)；②成本與效率：可從低至 0.3×10⁵ cells/mL 的密度起始，每日僅需添加培養(yǎng)基（無需 80% 換液），降低試劑消耗和操作時間；③穩(wěn)定性：10 代擴(kuò)增后仍保持正常核型、三胚層分化潛能及多能性；④靈活性：支持 2D 與 3D 培養(yǎng)無縫轉(zhuǎn)換，兼容 mTeSR 和 E8 兩種培養(yǎng)基。

mTeSR 和 E8 培養(yǎng)基在該系統(tǒng)中應(yīng)用時的主要差異是什么？
答：主要差異體現(xiàn)在培養(yǎng)周期和代謝動力學(xué)：①培養(yǎng)周期：mTeSR 可維持 4 天培養(yǎng)，Tra1-60 表達(dá)仍 > 90%；E8 中 Tra1-60 表達(dá)在第 3 天達(dá)高峰（88.4±1.7%），第 4 天顯著下降（61.8±29.3%），需縮短培養(yǎng)周期；②代謝：mTeSR 中葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生從第 4 天驟升，E8 則從第 3 天開始；③擴(kuò)增倍數(shù)：低接種密度下，mTeSR 最大擴(kuò)增 20 倍，E8 為 14 倍，但兩者長期平均擴(kuò)增率無顯著差異。

該系統(tǒng)對基于 hiPSC 的醫(yī)學(xué)研究有何推動作用？
答：①標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞制造：提供可重復(fù)的擴(kuò)增方法，減少批次差異，利于多中心研究數(shù)據(jù)比對；②支持大規(guī)模生物銀行：可平行擴(kuò)增多患者特異性 hiPSC 系，滿足疾病建模中對大樣本量的需求；③臨床轉(zhuǎn)化潛力：兼容化學(xué)定義的 E8 培養(yǎng)基，符合臨床級細(xì)胞生產(chǎn)要求，為細(xì)胞替代療法提供高質(zhì)量細(xì)胞來源；④簡化實驗流程：2D 與 3D 的無縫轉(zhuǎn)換便于整合下游分化實驗，加速藥物篩選和疾病機(jī)制研究。

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