細(xì)胞外囊泡（EVs）是由所有細(xì)胞釋放的異質(zhì)性膜顆粒家族，為多種生理過程及疾病研究提供關(guān)鍵信息。深入研究EVs需對其精確表征，然而其異質(zhì)性、尺寸不均一性、折射指數(shù)及復(fù)雜性使其分析極具挑戰(zhàn)。

一起來看下具備優(yōu)秀靈敏度和分辨率的4激光6色的CytoFLEX nano納米流式分析儀是如何應(yīng)對的：

CytoFLEX nano納米流式分析儀通過405 nm激光激發(fā)側(cè)向散射光可檢測小至40納米的顆粒，六色熒光檢測通道提供更優(yōu)的靈敏度與分辨率。
以下研究采用5色組合方案，對乏血小板血漿（PPP）樣本中的EVs亞群進(jìn)行免疫表型表征。

方法

乏血小板血漿（PPP）細(xì)胞外囊泡制備流程如下：

1 取3 mL新鮮人全血，200 xg離心5分鐘；
2 吸取上層血漿1 mL，經(jīng)200 nm注射器過濾器初濾后，采用iZON qEV 70 nm尺寸排阻色譜柱（SEC）純化PPP；
3 篩選特定組分分別進(jìn)行單色及多色染色用于免疫分型；
4 所選PPP組分使用以下抗體標(biāo)記：CD81 PB、CD9 FITC、CD63 APC、CD61 PC7、CD235a PE；
5 樣本經(jīng)CytoFLEX nano納米流式分析儀檢測，數(shù)據(jù)通過CytExpert for nano軟件分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：對聚集體的檢測

圖2：樣本稀釋優(yōu)化方案-非群集條件與穩(wěn)定MdFI

（經(jīng)篩選確定樣本稀釋度，確保滿足：1. 非群集狀態(tài)（<6000 eps）；2. 事件收集率100%；3. 稀釋梯度內(nèi)MdFI穩(wěn)定性）

圖3：目標(biāo)組分篩選結(jié)果

（選定粒徑分布最寬的組分5）

圖4：五色抗體組合的單色質(zhì)控策略

（執(zhí)行單色對照實(shí)驗(yàn)以計(jì)算熒光補(bǔ)償）

圖5：五色抗體組合熒光補(bǔ)償校正及亞群分析策略

（CytExpert nano軟件精準(zhǔn)補(bǔ)償；通過設(shè)門鑒定：1. 紅細(xì)胞陰性EVs；2. 血小板源性EVs；3. 非血小板源性EVs）

設(shè)門策略分步解析

1 單顆粒群圈定；
2 排除CD235+事件（疑似聚集體）；
3 在CD235-群體中鑒定CD61+（血小板源性EVs）和CD61-；
4 進(jìn)一步區(qū)分：CD9+亞群和CD9-亞群；
5 在以上亞群中鑒定CD81+和CD63+。

圖6：特征性EVs亞群鑒定
（設(shè)門策略示例圖示）

結(jié)論
基于iZON qEV 70 nm色譜柱收集組分的粒徑分布與熒光染色特征，本研究成功定位細(xì)胞外囊泡（EVs）富集組分。CytoFLEX nano納米流式分析儀可檢測單個(gè)PPP-EV顆粒上多種熒光信號（包括PB、FITC、PE、PC7及APC）。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)：
在優(yōu)化抗體濃度并設(shè)置合理對照條件下，可有效規(guī)避抗體聚集體及背景干擾；同時(shí)CytoFLEX nano納米流式分析儀能實(shí)現(xiàn)不同熒光染料間的溢漏補(bǔ)償校正，確保五色標(biāo)記同步分析，最終通過免疫表型染色成功鑒定多個(gè)EVs亞群。