自由移動(dòng)動(dòng)物雙光子成像：新型顯微鏡實(shí)時(shí)三維運(yùn)動(dòng)校正功能
這項(xiàng)研究名為“Closed-loop two-photon functional imaging in a freely moving animal”，由Paul McNulty、Rui Wu、Akihiro Yamaguchi、Ellie S. Heckscher、Andrew Haas、Amajindi Nwankpa、Mirna Mihovilovic Skanata和Marc Gershow共同完成。該論文于2025年7月在《Nature Communications》期刊上在線發(fā)表。這項(xiàng)工作不僅解決了運(yùn)動(dòng)偽影的難題，還首次在自由爬行的果蠅幼蟲(chóng)中實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞分辨率的功能成像，揭示了先前未知的神經(jīng)行為關(guān)聯(lián)。
重要發(fā)現(xiàn)
01CRASH2p顯微鏡的技術(shù)原理與實(shí)現(xiàn)
本研究核心貢獻(xiàn)是開(kāi)發(fā)了閉環(huán)諧振軸向掃描高速雙光子（CRASH2p）顯微鏡，能夠在自由移動(dòng)動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)三維運(yùn)動(dòng)校正的體積功能成像。傳統(tǒng)雙光子顯微鏡對(duì)運(yùn)動(dòng)高度敏感，且需物理連接限制動(dòng)物行為，而CRASH2p通過(guò)雙掃描頭設(shè)計(jì)（跟蹤頭和成像頭）實(shí)現(xiàn)了無(wú)創(chuàng)成像。跟蹤頭使用1070納米脈沖激光專用于跟蹤單個(gè)參考神經(jīng)元（通過(guò)鈣不敏感紅色熒光蛋白mCherry標(biāo)記），通過(guò)圓柱形掃描和卡爾曼濾波實(shí)時(shí)估計(jì)神經(jīng)元位置，并以亞毫秒延遲和亞微米精度反饋至成像系統(tǒng)。成像頭則采用920納米激光激發(fā)綠色鈣指示劑（如GCaMP6f），并結(jié)合“Pong”掃描策略進(jìn)行體積成像。Pong掃描通過(guò)三角波驅(qū)動(dòng)x和y軸掃描器，替代傳統(tǒng)光柵掃描，消除了慢軸問(wèn)題，使采樣更均勻分布，有助于校正旋轉(zhuǎn)和變形。雙色成像允許通過(guò)紅色通道校正運(yùn)動(dòng)引起的熒光變化，確保綠色信號(hào)準(zhǔn)確反映神經(jīng)活動(dòng)。
實(shí)驗(yàn)在自由爬行的果蠅幼蟲(chóng)中進(jìn)行，幼蟲(chóng)在瓊脂糖包被的蓋玻片上爬行，顯微鏡通過(guò)實(shí)時(shí)跟蹤參考神經(jīng)元來(lái)穩(wěn)定成像體積。研究重點(diǎn)關(guān)注了幼蟲(chóng)腹神經(jīng)索（VNC）中的節(jié)段重復(fù)中間神經(jīng)元，如A27h premotor神經(jīng)元和Even-skipped+ lateral（EL）本體感覺(jué)神經(jīng)元。通過(guò)雙色標(biāo)記（GCaMP6f/mCherry），CRASH2p記錄了在前進(jìn)和后退爬行期間的神經(jīng)活動(dòng)。成像數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)多階段配準(zhǔn)管道處理：先校正剛性運(yùn)動(dòng)（旋轉(zhuǎn)和平移），再通過(guò)B樣條基自由形變校正非剛性變形，最后應(yīng)用強(qiáng)度校正以消除空間不均一熒光變化。結(jié)果顯示，在前進(jìn)爬行時(shí)，A27h神經(jīng)元的中央過(guò)程呈現(xiàn)后前傳播的活動(dòng)波，而在后退爬行時(shí)活動(dòng)被抑制；相反，M神經(jīng)元（與A27h形態(tài)相近）在后退爬行時(shí)表現(xiàn)活躍。這些發(fā)現(xiàn)通過(guò)主成分分析（PCA）進(jìn)一步驗(yàn)證，顯示活動(dòng)波具有解剖特異性，且綠色熒光變化與行為同步，而紅色通道無(wú)類似模式，排除了運(yùn)動(dòng)偽影。
03光學(xué)成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與驗(yàn)證
CRASH2p的光學(xué)設(shè)計(jì)顯著提升了成像性能。雙光子激發(fā)減少了散射和脫靶熒光的影響，而閉環(huán)跟蹤補(bǔ)償了平移運(yùn)動(dòng)。Pong掃描策略通過(guò)高頻采樣（如400 kHz軸向線速率）實(shí)現(xiàn)了10 Hz體積成像速率，確保在毫米/秒級(jí)運(yùn)動(dòng)下保持微米級(jí)分辨率。此外，時(shí)間多路復(fù)用技術(shù)將跟蹤和成像路徑的紅色光子分離，避免了串?dāng)_。實(shí)驗(yàn)還通過(guò)對(duì)照組（如GFP標(biāo)記的幼蟲(chóng)）驗(yàn)證了信號(hào)特異性：在GCaMP標(biāo)記的動(dòng)物中，旅行波表示解釋了大部分方差，而GFP對(duì)照組無(wú)此現(xiàn)象，證實(shí)了鈣指示劑的動(dòng)態(tài)響應(yīng)。這些技術(shù)使得在自由行為中首次觀察到EL神經(jīng)元在前進(jìn)爬行時(shí)的活動(dòng)波，以及Mooncrawler Descending Neuron（MDN）在后退爬行時(shí)的活動(dòng)增強(qiáng)，突出了細(xì)胞分辨率成像的重要性。
創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破傳統(tǒng)成像難題
CRASH2p顯微鏡突破了自由移動(dòng)動(dòng)物中雙光子成像的長(zhǎng)期難題。傳統(tǒng)方法受限于運(yùn)動(dòng)偽影，尤其是昆蟲(chóng)等小動(dòng)物，其大腦在行為中會(huì)發(fā)生劇烈變形。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)閉環(huán)跟蹤，無(wú)需植入標(biāo)記物即可補(bǔ)償三維平移，結(jié)合Pong掃描和非剛性配準(zhǔn)，校正了旋轉(zhuǎn)和變形，實(shí)現(xiàn)了在果蠅幼蟲(chóng)中的穩(wěn)定體積成像。這解決了單光子成像中散射敏感和雙光子成像中運(yùn)動(dòng)敏感的權(quán)衡問(wèn)題，為研究自然行為下的神經(jīng)電路提供了新途徑。
技術(shù)亮點(diǎn)包括雙掃描頭設(shè)計(jì)、諧振TAG透鏡軸向掃描和時(shí)間多路復(fù)用檢測(cè)。Pong掃描作為關(guān)鍵創(chuàng)新，通過(guò)三角波驅(qū)動(dòng)替代正弦Lissajous掃描，提高了采樣均勻性，減少了運(yùn)動(dòng)失真。多階段配準(zhǔn)管道結(jié)合了剛性校正、B樣條形變和強(qiáng)度平滑，確保熒光比率計(jì)量的準(zhǔn)確性。這些技術(shù)使得成像速度達(dá)10 Hz體積速率，在200毫秒內(nèi)完成200×200×50微米體積采樣，同時(shí)保持細(xì)胞分辨率。此外，雙色成像策略通過(guò)紅色參考通道校正了光學(xué)路徑變化，提升了信號(hào)可靠性。
03科學(xué)價(jià)值與應(yīng)用前景
CRASH2p的價(jià)值體現(xiàn)在推動(dòng)模型生物研究上。果蠅幼蟲(chóng)作為系統(tǒng)神經(jīng)科學(xué)模型，具有遺傳工具豐富、神經(jīng)元可識(shí)別和全腦連接組圖譜完整等優(yōu)勢(shì)，但此前難以在自由行為中記錄活動(dòng)。本研究不僅發(fā)現(xiàn)了A27h和M神經(jīng)元在相反行為模式中的分工，還證實(shí)了EL神經(jīng)元的本體感覺(jué)角色，為運(yùn)動(dòng)控制和本體感覺(jué)研究提供了新見(jiàn)解。技術(shù)通用性高，可擴(kuò)展至其他小動(dòng)物或厚組織成像，潛在應(yīng)用包括行為神經(jīng)科學(xué)、疾病模型和光學(xué)遺傳學(xué)操縱。
總結(jié)與展望
CRASH2p顯微鏡的成功開(kāi)發(fā)標(biāo)志著自由移動(dòng)動(dòng)物中雙光子功能成像的重大進(jìn)步，通過(guò)實(shí)時(shí)運(yùn)動(dòng)校正和體積成像，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞分辨率的神經(jīng)活動(dòng)記錄。這項(xiàng)技術(shù)不僅克服了傳統(tǒng)成像的運(yùn)動(dòng)限制，還揭示了果蠅幼蟲(chóng)VNC中節(jié)段神經(jīng)元的動(dòng)態(tài)活動(dòng)波，為理解行為控制的神經(jīng)基礎(chǔ)提供了新證據(jù)。未來(lái)，該技術(shù)可進(jìn)一步優(yōu)化，如集成旋轉(zhuǎn)跟蹤以提升校正能力，或結(jié)合高速成像技術(shù)（如FACED或LBM）實(shí)現(xiàn)更高幀率。此外，擴(kuò)展至密集標(biāo)記組織或其他模型生物將拓寬其在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用。總之，CRASH2p為研究自然行為下的全腦活動(dòng)開(kāi)辟了新道路，有望推動(dòng)精準(zhǔn)神經(jīng)環(huán)路解析和行為學(xué)研究的發(fā)展。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
McNulty P, Wu R, Yamaguchi A, Heckscher ES, Haas A, Nwankpa A, Skanata MM, Gershow AM. Closed-loop two-photon functional imaging in a freely moving animal. Nat Commun. 2025 Jul 1;16(1):5950.
DOI:10.1038/s41467-025-60648-x.
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