180微米深度高保真超分辨率成像重建圖像線性相關性高達92%
本研究成果由Qianxi Liang、Wei Ren、Boya Jin、Liang Qiao、Xichuan Ge、Yunzhe Fu、Xiaoqi Lv、Meiqi Li和Peng Xi共同完成，論文題為“High-fidelity tissue super-resolution imaging achieved with confocal2 spinning-disk image scanning microscopy”，于2025年發(fā)表在《Light: Science & Applications》期刊。
重要發(fā)現(xiàn)
01光學系統(tǒng)設計與硬件實現(xiàn)
C2SD-ISM系統(tǒng)的核心在于其創(chuàng)新的光學配置，它巧妙融合了旋轉盤共聚焦顯微鏡和數(shù)字微鏡設備。旋轉盤被放置在樣本共軛平面上，通過物理方式實時移除離焦信號，從而減少背景干擾對后續(xù)重建過程的影響。數(shù)字微鏡設備則用于生成稀疏多焦點照明模式，這種照明方式通過程序化控制實現(xiàn)高效采樣。系統(tǒng)采用多模激光作為光源，并結合方形勻化光纖，確保照明均勻且無散斑。光學路徑中，樣本焦平面、旋轉盤針孔陣列、數(shù)字微鏡設備和sCMOS傳感器平面均處于共軛狀態(tài)，保證了成像的精確性。數(shù)字微鏡設備的衍射特性經(jīng)過系統(tǒng)優(yōu)化，入射角設置為26.3°，可在多色成像（如561nm、488nm和405nm波長）中實現(xiàn)超過95%的衍射效率，出口角差異控制在可接受范圍內，從而避免了視場偏差和照明不均問題。
旋轉盤的設計采用阿基米德螺旋排列的針孔陣列，通過電子束光刻和蝕刻工藝制成。為了提升成像速度，研究團隊開發(fā)了多同心螺旋設計（N>1），將全視場分為N個子區(qū)域進行并行掃描。理論表明，這種設計可將均勻照明速度提升N倍，例如當N=12時，曝光時間間隔縮短至原設計的1/12，從而簡化了與旋轉速度的同步操作。針孔直徑與間距的比值設置為50μm:250μm，以平衡信噪比和分辨率。實驗驗證表明，旋轉盤能有效增強成像對比度：在小鼠腎臟組織切片成像中，引入旋轉盤后，局部對比度提升約三倍，且多焦點照明模式下的信噪比和點信號清晰度顯著改善。這為后續(xù)算法重建提供了高質量輸入數(shù)據(jù)。
03DPA-PR重建算法的高保真實現(xiàn)
傳統(tǒng)圖像掃描顯微鏡重建通�；诶硐朦c擴散函數(shù)假設，但實際系統(tǒng)中存在斯托克斯位移和光學像差，導致重建保真度下降。C2SD-ISM系統(tǒng)引入了動態(tài)針孔陣列像素重分配算法，該算法通過構建虛擬探測器陣列來模擬多視角成像。具體過程包括：首先定位照明光學軸，然后對原始圖像進行采樣和重組，生成25張共聚焦子圖像，最后通過相位互相關進行配準和疊加。重建結果進一步通過去卷積處理，實現(xiàn)近兩倍的分辨率提升。與常規(guī)像素重分配方法相比，DPA-PR算法能自適應校正非理想因素，重建圖像與衍射極限共聚焦圖像的峰值信噪比和結構相似性指數(shù)更高，線性相關性R²達到0.92，顯著降低了偽影。
04成像性能與生物應用驗證
通過模擬實驗和生物組織成像，C2SD-ISM系統(tǒng)展現(xiàn)了卓越的3D分辨率提升。在合成微管數(shù)據(jù)集中，引入旋轉盤后，DPA-PR重建的橫向分辨率提升至144納米，軸向分辨率達351納米，且結構細節(jié)更清晰。與計算背景去除算法（如滾動球和小波去噪）相比，旋轉盤的物理離焦信號去除能更好地保留樣本結構信息，實現(xiàn)更高的保真度。在實際生物樣本如小鼠腎臟切片中，系統(tǒng)在12微米厚度樣本上實現(xiàn)了高對比度成像，穿透深度達180微米。多色成像實驗進一步驗證了系統(tǒng)在tri-color標記樣本（如線粒體、F-肌動蛋白和細胞核）中的穩(wěn)定性，視場均勻性無波長差異。此外，系統(tǒng)的高通量能力通過斑馬魚血管3D成像得到體現(xiàn)，拼接成像覆蓋2.91 mm x 1.26 mm x 0.18 mm體積，分辨率媲美高數(shù)值孔徑物鏡的共聚焦成像。
創(chuàng)新與亮點
C2SD-ISM系統(tǒng)的核心創(chuàng)新在于突破了深層組織超分辨率成像的多個技術難題。首先，通過雙共聚焦策略物理性消除離焦信號，解決了傳統(tǒng)計算方法導致的信號失真問題。旋轉盤技術的引入不僅提升了成像對比度，還保留了原始強度分布，為高保真重建奠定了基礎。其次，動態(tài)針孔陣列像素重分配算法克服了理想點擴散函數(shù)假設的局限性，能自適應校正斯托克斯位移和光學像差，實現(xiàn)近乎理論極限的分辨率提升。此外，數(shù)字微鏡設備的程序化控制使系統(tǒng)支持多模態(tài)成像，如投影式結構化照明顯微鏡，進一步擴展了應用場景。系統(tǒng)價值體現(xiàn)在其高通用性上：它兼具高分辨率（橫向144納米、軸向351納米）、大穿透深度（180微米）和高通量能力，適用于從細胞成像到組織尺度探索的多種生物研究需求。與現(xiàn)有技術相比，C2SD-ISM在保持高速成像的同時，顯著降低了光毒性和偽影，為活體動態(tài)過程研究提供了新可能。
總結與展望
C2SD-ISM系統(tǒng)通過集成旋轉盤共聚焦顯微鏡和數(shù)字微鏡設備，結合創(chuàng)新算法，成功實現(xiàn)了高保真深層組織超分辨率成像。該系統(tǒng)在分辨率、穿透深度和重建保真度方面均表現(xiàn)出色，為生物醫(yī)學研究提供了強大工具。未來，通過整合自適應光學技術，系統(tǒng)可進一步校正樣本誘導像差，提升在復雜生物結構中的成像精度。長波長熒光探針和非線性激發(fā)策略（如雙光子吸收）的引入，有望減少散射和自發(fā)熒光，擴展穿透深度。此外，深度學習算法的應用可優(yōu)化重建過程，降低數(shù)據(jù)采集需求，實現(xiàn)實時超分辨率成像。C2SD-ISM平臺的靈活性和可擴展性使其在動態(tài)生物過程觀測和大規(guī)模生物研究中具有廣闊前景，有望深化我們對復雜生物系統(tǒng)的理解。
聲明：本文僅用作學術目的。
Liang Q, Ren W, Jin B, Qiao L, Ge X, Fu Y, Lv X, Li M, Xi P. High-fidelity tissue super-resolution imaging achieved with confocal2 spinning-disk image scanning microscopy. Light Sci Appl. 2025 Aug 4;14(1):260.
DOI:10.1038/s41377-025-01930-x.
