文章來(lái)源公眾號(hào)：生物屋             作者：屋中人

01 引言
抗體是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，由B細(xì)胞產(chǎn)生，用于特異性識(shí)別和中和多種抗原，如病毒、病原體和惡性細(xì)胞。自從Köhler和Milstein在開發(fā)雜交瘤技術(shù)方面的開創(chuàng)性工作以來(lái)，單克隆抗體(mAbs)已成為基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)中不可或缺的工具。迄今為止，已有超過(guò)100種治療性抗體被批準(zhǔn)用于臨床，為自身免疫性疾病、代謝疾病、傳染病和多種癌癥提供了有效的治療選擇。治療性抗體的開發(fā)傳統(tǒng)上依賴于幾種策略，包括動(dòng)物免疫、組合抗體庫(kù)、B細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基因小鼠的使用，這些方法使得能夠發(fā)現(xiàn)具有理想治療特性的高親和力抗體。最近，計(jì)算生物學(xué)和人工智能(AI)的進(jìn)展為抗體發(fā)現(xiàn)引入了強(qiáng)大的新方法。這些工具，如用于結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的AlphaFold3、分子對(duì)接和從頭設(shè)計(jì)，正越來(lái)越多地與生成擴(kuò)散模型相結(jié)合，以創(chuàng)造出具有更高特異性、親和力和功效的抗體。在本綜述中，我們總結(jié)了五種主要的抗體生成方法，這些方法(圖1)正在擴(kuò)展治療性抗體發(fā)現(xiàn)的領(lǐng)域，提供了加速開發(fā)和改善人類疾病治療的創(chuàng)新策略。

圖1. 治療性抗體開發(fā)的五種關(guān)鍵方法概述：(a) 小鼠雜交瘤, (b) 噬菌體展示, (c) 轉(zhuǎn)基因小鼠, (d) 單B細(xì)胞分離, 和(e)從頭設(shè)計(jì)。 每種方法通過(guò)不同的免疫、篩選或計(jì)算策略實(shí)現(xiàn)單克隆抗體的生成。
(a) 小鼠雜交瘤技術(shù)： 用靶抗原免疫小鼠，將脾臟B細(xì)胞與永生化骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤。篩選雜交瘤克隆以獲取特異性抗體生產(chǎn)，隨后通過(guò)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植進(jìn)行抗體人源化。
(b) 噬菌體展示： 以單鏈可變片段(scFv)、抗原結(jié)合片段(Fab)或單域抗體(VHH)格式生成組合抗體庫(kù)。針對(duì)固定化抗原進(jìn)行多輪生物淘選，富集高親和力結(jié)合物用于篩選和IgG重建。
(c) 轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)： 對(duì)表達(dá)人類免疫球蛋白基因的基因工程小鼠進(jìn)行靶抗原免疫。從脾臟中分離產(chǎn)生人抗體的B細(xì)胞并進(jìn)行篩選以獲得全人源抗體。
(d) 單B細(xì)胞分離： 從免疫過(guò)或患者的人類供體收集外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分離抗原特異性B細(xì)胞，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增抗體基因，并克隆到表達(dá)載體中以獲得全人源抗體。
(e) 從頭(De novo)抗體設(shè)計(jì)： 使用人工智能(AI)和基于結(jié)構(gòu)的建模，從支架結(jié)構(gòu)計(jì)算生成抗體序列。預(yù)測(cè)的抗體被表達(dá)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其親和力、穩(wěn)定性和功能。

02 雜交瘤技術(shù)
多年來(lái)，抗體一直是生物醫(yī)學(xué)研究中的重要工具，在多個(gè)領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用�？贵w的高特異性和選擇性結(jié)合已將其應(yīng)用擴(kuò)展到流式細(xì)胞術(shù)、磁性細(xì)胞分選、免疫分析、治療方法等。1975年，基于雜交瘤的技術(shù)被用于生產(chǎn)批次間變異最小的單克隆抗體，實(shí)現(xiàn)了持續(xù)和無(wú)限的生產(chǎn)。雜交瘤技術(shù)由Kohler和Milstein于1975年首次發(fā)明，作為獲取單克隆抗體的一種方法，涉及將免疫動(dòng)物(如小鼠)脾臟中產(chǎn)生的B細(xì)胞與永生化骨髓瘤細(xì)胞融合。雜交瘤技術(shù)是最原始、最基礎(chǔ)且最成功的分離單克隆抗體的方法，這項(xiàng)技術(shù)引人注目，并已被用于發(fā)現(xiàn)數(shù)千種用于各種應(yīng)用的抗體。雜交瘤技術(shù)的基本實(shí)際優(yōu)勢(shì)在于，一旦雜交瘤克隆建立，單克隆抗體的生產(chǎn)就變得簡(jiǎn)單而高效。該技術(shù)仍然廣泛用于抗體治療和診斷試劑的開發(fā)，其核心價(jià)值在于保留了來(lái)自B細(xì)胞自然重組過(guò)程的抗體序列完整性和生物活性。第一種治療性單抗，莫羅單抗-CD3(Orthoclone OKT3)，于1986年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)，它包含一種針對(duì)T細(xì)胞表達(dá)的CD3的小鼠單抗，作為免疫抑制劑用于治療急性移植排斥反應(yīng)。為了規(guī)避免疫原性潛力和功效降低的問(wèn)題，同時(shí)使抗體能夠長(zhǎng)期治療使用，研究人員開發(fā)了技術(shù)將嚙齒類動(dòng)物抗體轉(zhuǎn)化為更類似于人抗體的結(jié)構(gòu)，而不損失結(jié)合特性。隨后，第一種具有腫瘤適應(yīng)癥的單抗，利妥昔單抗，一種嵌合抗CD20 IgG1，于1997年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療非霍奇金淋巴瘤。最近的創(chuàng)新，例如通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)富集的抗體分泌細(xì)胞(ASCs)的電融合，顯著提高了融合效率和功能性雜交瘤產(chǎn)量。通過(guò)選擇具有高跨膜激活劑和CAML相互作用因子(TACI)和CD138表達(dá)的ASC亞群，研究人員實(shí)現(xiàn)了超過(guò)60%的抗原特異性單抗生產(chǎn)，且具有納摩爾級(jí)親和力。這些改進(jìn)克服了先前隨機(jī)配對(duì)和低PEG介導(dǎo)融合的限制，將雜交瘤定位為一個(gè)復(fù)興的、高產(chǎn)量的治療和診斷抗體開發(fā)平臺(tái)。

除了小鼠雜交瘤，兔單克隆抗體也可以從雜交瘤技術(shù)中產(chǎn)生，兔抗體顯示出優(yōu)異的親和力、更廣泛的表位識(shí)別(包括隱蔽或構(gòu)象表位)以及更高的治療和診斷靈敏度。兔單克隆抗體在幾個(gè)關(guān)鍵免疫學(xué)維度上超越了其鼠源對(duì)應(yīng)物：
·卓越的親和力——增強(qiáng)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)能夠?qū)崿F(xiàn)更精確的抗原檢測(cè)和靶向。
·擴(kuò)展的表位識(shí)別——能夠識(shí)別結(jié)構(gòu)復(fù)雜或在小鼠中免疫原性差的表位。
·對(duì)翻譯后修飾的敏感性——非常適合檢測(cè)疾病狀態(tài)下細(xì)微的生化變化。

兔單克隆抗體(RabMAbs)提供高特異性和親和力，通常能夠識(shí)別鼠源抗體無(wú)法接近的表位，使其對(duì)于抗體-藥物偶聯(lián)物(ADCs)和檢查點(diǎn)抑制劑具有價(jià)值。FDA批準(zhǔn)了brolucizumab，一種針對(duì)VEGF-A的兔源ScFv，標(biāo)志著首個(gè)治療性RabMAb的誕生。Brolucizumab是一種單鏈可變片段(ScFv)單抗，能有效抑制VEGF。由于其小尺寸，與其他治療性單抗形式相比，ScFv可以以更高濃度遞送，并且可以更有效地穿透組織以發(fā)揮其治療作用。然而，使brolucizumab與其他單抗區(qū)別開的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是，它是一種源自兔的人源化ScFv，使得這種單抗成為市場(chǎng)上的首創(chuàng)。相比之下，大多數(shù)其他治療性單抗源自小鼠。其他例子包括Zilovertamab vedotin，一種針對(duì)受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)的ADC，以及OR502，靶向白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體B2(LILRB2)以增強(qiáng)抗腫瘤免疫力。

03 噬菌體展示技術(shù)
噬菌體展示是首個(gè)用于體外抗體篩選的技術(shù)，并且仍然是使用最廣泛的方法。該技術(shù)由George P. Smith于1985年首次描述，他證明了絲狀噬菌體可以通過(guò)將DNA插入外殼蛋白基因而在其表面呈現(xiàn)外源肽，該技術(shù)已得到廣泛發(fā)展。主要進(jìn)展來(lái)自分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(英國(guó)劍橋)的Winter和McCafferty，斯克里普斯研究所(美國(guó)拉霍亞)的Lerner和Barbas，以及德國(guó)癌癥研究中心(德國(guó)海德堡)的Breitling和Dubel，他們開創(chuàng)了在絲狀噬菌體中構(gòu)建組合抗體庫(kù)的工作。這些里程碑牢固確立了噬菌體展示作為治療性抗體工程的強(qiáng)大平臺(tái)，導(dǎo)致了全人源抗體的開發(fā)。組合抗體庫(kù)是通過(guò)使用PCR從B細(xì)胞、免疫供體或患者擴(kuò)增VH和VL區(qū)域，然后克隆到與噬菌體外殼蛋白(如pIII)融合的噬菌粒載體中來(lái)構(gòu)建的。這創(chuàng)建了直接的基因型-表型聯(lián)系，使得抗體片段能夠在噬菌體表面展示。庫(kù)可以超過(guò) 10^11 個(gè)變體，提供廣泛的多樣性。針對(duì)固定化抗原進(jìn)行結(jié)合、洗滌和洗脫的迭代輪次富集了抗原特異性噬菌體，之后通過(guò)ELISA篩選結(jié)合物，進(jìn)行測(cè)序，并重新格式化為scFv、Fab或IgG分子進(jìn)行測(cè)試。重要的是，噬菌體展示繞過(guò)了免疫耐受，允許產(chǎn)生針對(duì)自身抗原(如TNF-α)的抗體。阿達(dá)木單抗(Humira)的批準(zhǔn)，第一種噬菌體展示來(lái)源的全人單克隆抗體，說(shuō)明了其臨床意義。有許多噬菌體展示來(lái)源的人源抗體獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療人類疾病，證明了該技術(shù)作為抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的可靠性。

除了常規(guī)的結(jié)合物選擇，噬菌體展示已經(jīng)發(fā)展到能夠?qū)崿F(xiàn)直接的功能性抗體發(fā)現(xiàn)，如圖2所示。功能性抗體的鑒定已成為研究的中心焦點(diǎn)，體內(nèi)和表型篩選方法進(jìn)一步拓寬了噬菌體展示的應(yīng)用。在整個(gè)生物體中進(jìn)行基于遷移的選擇揭示了能夠調(diào)節(jié)受體多效性和細(xì)胞分化的抗體，這些策略使得能夠鑒定出驅(qū)動(dòng)干細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、棕色脂肪細(xì)胞或β樣細(xì)胞命運(yùn)的抗體。基于形態(tài)學(xué)的篩選甚至產(chǎn)生了能夠防止病毒誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體。在腫瘤學(xué)中，功能性噬菌體展示已鑒定出激活非經(jīng)典通路的激動(dòng)劑抗體和一種針對(duì)PKM2的抗凋亡胞內(nèi)抗體，揭示了腫瘤存活的機(jī)制。這些進(jìn)展說(shuō)明了噬菌體展示如何演變成一個(gè)多功能發(fā)現(xiàn)引擎，用于尋找超越單純結(jié)合功能的治療性抗體。此外，從雜交瘤或噬菌體展示獲得的抗體通常經(jīng)過(guò)進(jìn)一步工程化以改善結(jié)合。通過(guò)在VH/VL區(qū)域引入突變并重新選擇改進(jìn)的克隆，噬菌體展示模擬了在V(D)J重組后發(fā)生在生發(fā)中心的自然親和力成熟過(guò)程。這個(gè)過(guò)程富集了具有更高抗原親和力的變體，有時(shí)達(dá)到低皮摩爾級(jí)的結(jié)合強(qiáng)度，并且對(duì)于優(yōu)化抗體用于治療用途至關(guān)重要。

圖2. 調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)的功能性抗體發(fā)現(xiàn)示意圖。

通過(guò)慢病毒遞送抗體庫(kù)使得抗體能夠在細(xì)胞內(nèi)和表面表達(dá)。在細(xì)胞和體內(nèi)進(jìn)行功能性選擇，鑒定出能夠調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)、分化和細(xì)胞命運(yùn)的抗體。功能性抗體可以誘導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)的改變，能夠被分泌、在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)、錨定在質(zhì)膜上。通過(guò)使用抗體庫(kù)，可以在細(xì)胞環(huán)境中分離功能性抗體，并修飾細(xì)胞表面信號(hào)組件的功能。這些抗體還可以以自分泌或旁分泌方式影響細(xì)胞存活、增殖和譜系分化，為發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和命運(yùn)決定的抗體提供了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)。

04 轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)
源自野生型小鼠的抗體通常需要廣泛的下游工程化以消除免疫原性鼠源序列并確保與人類Fc受體的正確相互作用。雖然野生型小鼠廣泛可用且使用簡(jiǎn)單，但它們對(duì)于治療性抗體發(fā)現(xiàn)并非最佳選擇。為了應(yīng)對(duì)免疫原性的挑戰(zhàn)，設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)基因小鼠模型以產(chǎn)生全人源抗體。然而，這些模型的早期世代缺乏鼠源恒定區(qū)，導(dǎo)致B細(xì)胞發(fā)育缺陷和小鼠體內(nèi)抗體成熟受損。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的原理是通過(guò)基因工程將人類免疫球蛋白(Ig)基因引入小鼠基因組，使小鼠能夠產(chǎn)生全人源抗體。這通常通過(guò)胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中的同源重組或通過(guò)將重組人抗體基因片段顯微注射到受精卵中，然后進(jìn)行胚胎移植和育種以建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因品系來(lái)實(shí)現(xiàn)。整合的人Ig基因與小鼠免疫系統(tǒng)協(xié)同作用，確保正常的B細(xì)胞發(fā)育、體細(xì)胞高頻突變和親和力成熟。與野生型小鼠相比，這些轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生具有更高臨床相關(guān)性、更低免疫原性并保留免疫監(jiān)視功能的人源抗體。

·第一個(gè)里程碑報(bào)道于1989年，Brüggemann等構(gòu)建了一個(gè)包含兩個(gè)VH片段、多樣性(D)元件、JH簇和μ恒定區(qū)的人重鏈基因盒。這個(gè)25 kb的構(gòu)建體通過(guò)顯微注射到受精卵中隨機(jī)整合到小鼠基因組中，大約4%的B細(xì)胞表達(dá)人μ鏈，并且可以從這些小鼠中產(chǎn)生產(chǎn)生人IgM的雜交瘤。

·Taylor等引入了一個(gè)包含單個(gè)Vκ、Jκ簇和Cκ的人κ輕鏈構(gòu)建體，共表達(dá)人VH-D-JH-Cμ-Cγ1和κ構(gòu)建體的小鼠能夠產(chǎn)生人源抗體，但水平低于總Ig的10%，反映了與內(nèi)源性鼠源Ig表達(dá)的有限兼容性。同時(shí)，開發(fā)了基因敲除小鼠模型以消除內(nèi)源性鼠源Ig的產(chǎn)生。

·1993年，Chen等通過(guò)靶向缺失破壞了鼠源JH和Jκ基因座，廢除了天然Ig的表達(dá)。當(dāng)與人類IgH和IgL轉(zhuǎn)基因品系雜交時(shí)，這些敲除小鼠顯示出更廣泛的人源抗體庫(kù)。

·一個(gè)重大進(jìn)展出現(xiàn)在1994年，Lonberg等產(chǎn)生了HuMabMouse，這是第一個(gè)在鼠源Ig缺陷背景下攜帶人IgH和Igκ基因的小鼠品系。盡管完整的人IgH和Igκ基因座跨越1.29 Mb和1.39 Mb，但引入的構(gòu)建體小于80 kb，這限制了抗體的多樣性。

·隨后，應(yīng)用了酵母人工染色體(YAC)技術(shù)。1993年，研究人員使用YAC成功組裝了人Igκ(~300 kb)和IgH(~85 kb)的大基因組片段。隨后，Green等通過(guò)酵母原生質(zhì)體-ES融合將基于YAC的人Igκ(~170 kb)和IgH(~220 kb)引入小鼠ES細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，Mendez等生成了更大的YAC構(gòu)建體，包括人Igκ(~700 kb)和IgH(~1 Mb)，并將它們引入Ig缺陷小鼠，創(chuàng)建了XenoMouse。

這些小鼠僅表達(dá)全人源抗體，不受鼠源Ig干擾。總之，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的開發(fā)提供了突破性的平臺(tái)，使得能夠高效生成全人源治療性抗體。除了XenoMouse，已經(jīng)開發(fā)了越來(lái)越多先進(jìn)的轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)，例如Atlas™ Mouse、HuMab Mouse和VelocImmune® Mouse。這些模型采用精確的基因敲入策略，用近乎全面的人源序列替換鼠源重鏈和輕鏈可變區(qū)，從而在保留自然結(jié)構(gòu)特征的同時(shí)增強(qiáng)抗體多樣性。更新一代的模型還融入了創(chuàng)新，如固定輕鏈或二元輕鏈策略，這簡(jiǎn)化了雙特異性抗體的高效生成，并改善了可開發(fā)性和藥代動(dòng)力學(xué)特性�？偟膩�(lái)說(shuō)，這些創(chuàng)新擴(kuò)展了治療性抗體的功能多樣性，并為藥物開發(fā)流程提供了更大的靈活性。盡管該技術(shù)仍然成本高昂且技術(shù)要求高，但此類轉(zhuǎn)基因小鼠模型正迅速成為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，在解決復(fù)雜疾病和滿足高臨床需求方面展現(xiàn)出巨大價(jià)值。

05 單B細(xì)胞技術(shù)
在人類免疫系統(tǒng)中，抗體反應(yīng)是強(qiáng)大的、高度特異性的，并且通常具有強(qiáng)效的中和作用。生成治療性單克隆抗體的傳統(tǒng)策略，如鼠源雜交瘤技術(shù)或使用轉(zhuǎn)基因小鼠，需要冗長(zhǎng)的免疫方案和廣泛的篩選。此外，鼠源抗體在人類中具有顯著的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，常常導(dǎo)致人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)的發(fā)展。為了克服這些限制，一個(gè)早期的替代方案是使用愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)轉(zhuǎn)化永生化人B細(xì)胞。雖然這種方法在某些條件下能夠生產(chǎn)人源抗體，但它存在關(guān)鍵缺陷，包括在某些供體中效率低下以及EBV轉(zhuǎn)化克隆的不穩(wěn)定性。一個(gè)變革性的進(jìn)展是單B細(xì)胞技術(shù)，它允許直接回收人源抗體而無(wú)需動(dòng)物免疫。使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，可以從單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增可變重鏈(VH)和輕鏈(VL)并進(jìn)行重組表達(dá)。B細(xì)胞通常從外周血單核細(xì)胞(PBMCs)、骨髓或淋巴組織中分離，通常在密度梯度離心后進(jìn)行，抗原特異性B細(xì)胞使用FACS基于階段特異性標(biāo)志物進(jìn)行鑒定和分選。早期的方法使用抗原包被的珠子來(lái)富集稀有B細(xì)胞，從而產(chǎn)生了第一批針對(duì)病毒病原體的人單克隆抗體。如今，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)和高通量單細(xì)胞克隆能夠快速鑒定和表達(dá)配對(duì)的VH/VL基因。這些方法通過(guò)提供一種高效、無(wú)動(dòng)物的策略徹底改變了抗體發(fā)現(xiàn)，特別適用于緊急公共衛(wèi)生危機(jī)，如新發(fā)病毒爆發(fā)，例如大流行性流感。這種策略的應(yīng)用已得到廣泛證實(shí)，例如，通過(guò)使用HIV包膜蛋白作為誘餌，從感染或接種疫苗的個(gè)體中分離出了針對(duì)HIV-1的廣泛中和抗體(bnAbs)。這些抗體通常靶向病毒膜糖蛋白上的保守表位，從而實(shí)現(xiàn)強(qiáng)效和交叉反應(yīng)性中和。最近，單B細(xì)胞方法使得能夠快速鑒定針對(duì)SARS-CoV-2的強(qiáng)效中和抗體，在COVID-19大流行開始后不久，就分離并表征了靶向刺突蛋白的抗體組合，為治療和疫苗設(shè)計(jì)提供了關(guān)鍵見解�？偟膩�(lái)說(shuō)，與傳統(tǒng)的雜交瘤方法相比，單B細(xì)胞抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)代表了一項(xiàng)變革性的進(jìn)步，能夠更快、更直接、更臨床相關(guān)地回收全人源單克隆抗體。

06 從頭抗體設(shè)計(jì)
傳統(tǒng)的抗體發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化技術(shù)，如雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示、轉(zhuǎn)基因小鼠、B細(xì)胞克隆等，被廣泛用于治療性抗體篩選。然而，其中一些方法勞動(dòng)密集、耗時(shí)且成本高昂，通常需要六個(gè)多月才能產(chǎn)生可行的抗體。隨后，通過(guò)同源建模、分子對(duì)接和基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)策略，進(jìn)行優(yōu)化步驟以增強(qiáng)結(jié)合親和力、生物物理穩(wěn)定性和可開發(fā)性。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)獲取、GPU計(jì)算機(jī)和機(jī)器學(xué)習(xí)(ML)的最新進(jìn)展預(yù)計(jì)將徹底改變抗體發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化篩選的過(guò)程，大量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、相互作用和功能數(shù)據(jù)的可用性為訓(xùn)練復(fù)雜的機(jī)器學(xué)習(xí)模型提供了大型數(shù)據(jù)集，而增強(qiáng)的計(jì)算能力使得能夠高效執(zhí)行復(fù)雜的模型和模擬。機(jī)器學(xué)習(xí)模型已廣泛用于蛋白質(zhì)研究，涵蓋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、轉(zhuǎn)換器和蛋白質(zhì)語(yǔ)言建模等技術(shù)。從頭抗體設(shè)計(jì)是指在不依賴天然模板的情況下生成新的抗體序列。最近的研究使用這種方法，通過(guò)模擬抗原-抗體相互作用界面，基于準(zhǔn)確的分子間相互作用建模，計(jì)算預(yù)測(cè)具有高結(jié)合親和力的序列。AlphaFold3和 RoseTTAFold模型在直接從氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面達(dá)到了高精度，生成模型如 ProteinBERT、ProteinMPNN和 RFdiffusion通過(guò)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)骨架、為特定結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)序列以及過(guò)濾低質(zhì)量蛋白質(zhì)候選物，推進(jìn)了計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)。研究人員可以使用這些模型來(lái)設(shè)計(jì)和優(yōu)化具有所需特性的蛋白質(zhì)，例如酶活性和結(jié)合能力。專門模型專注于抗體設(shè)計(jì)，特別是靶向互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)。IgFold可以使用預(yù)訓(xùn)練的語(yǔ)言模型和圖神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)快速預(yù)測(cè)抗體結(jié)構(gòu)，而像DiffAb這樣的模型可以用于聯(lián)合生成靶向CDR優(yōu)化的抗體序列和結(jié)構(gòu)。

圖3： 用于抗體設(shè)計(jì)的機(jī)器學(xué)習(xí)模式示意圖。

基于序列的模型利用氨基酸序列學(xué)習(xí)表示并生成新的變體，實(shí)現(xiàn)從頭設(shè)計(jì)�；�于結(jié)構(gòu)的模型結(jié)合結(jié)構(gòu)約束來(lái)指導(dǎo)序列生成和優(yōu)化。基于功能的模型利用實(shí)驗(yàn)、已發(fā)表數(shù)據(jù)或預(yù)測(cè)的功能蛋白質(zhì)(如催化活性或結(jié)合)進(jìn)行監(jiān)督學(xué)習(xí)。

用于功能性蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的機(jī)器學(xué)習(xí)涵蓋三個(gè)核心模式：基于序列的模型、基于結(jié)構(gòu)的模型和基于功能的模型(圖3)，每種模式利用不同的數(shù)據(jù)類型來(lái)優(yōu)化蛋白質(zhì)特性。

·基于序列的模型包括經(jīng)典的基于比對(duì)的方法，使用多序列比對(duì)來(lái)捕捉進(jìn)化約束，以及條件生成模型，如變分自編碼器和轉(zhuǎn)換器，它們基于家族特異性或序列同源性上下文生成新序列。一個(gè)生成對(duì)抗網(wǎng)絡(luò)(GAN)被設(shè)計(jì)出來(lái)，并在超過(guò)400,000個(gè)人類抗體輕鏈和重鏈序列上進(jìn)行了訓(xùn)練，有效地學(xué)習(xí)了抗體形成的基本原理。

·基于結(jié)構(gòu)的模型包括結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具，如AlphaFold3和RoseTTAFold，用于創(chuàng)建3D折疊的RF-diffusion模型，以及在結(jié)構(gòu)框架內(nèi)優(yōu)化序列的設(shè)計(jì)模型。David Baker的團(tuán)隊(duì)最近開發(fā)了RFdiffusion，一個(gè)用于從頭設(shè)計(jì)靶向流感血凝素和艱難梭菌毒素B(TcdB)的VHHs和scFvs的生成模型，它在結(jié)構(gòu)和表位靶向方面都達(dá)到了原子級(jí)精度。這些整合序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的方法越來(lái)越多地用于迭代優(yōu)化抗體設(shè)計(jì)，結(jié)合兩種模式的優(yōu)勢(shì)以增強(qiáng)功能結(jié)果。

·基于功能的模型側(cè)重于設(shè)計(jì)具有特定生物活性的抗體，通常從已知支架開始，并引入靶向突變以增強(qiáng)結(jié)合、特異性。這些方法經(jīng)常參考受體口袋、天然配體或激動(dòng)劑、拮抗劑相互作用來(lái)指導(dǎo)功能性抗體的設(shè)計(jì)，這些模型使得能夠合理設(shè)計(jì)激動(dòng)劑、拮抗劑和治療性蛋白質(zhì)。

總之，這些模式提供了加速蛋白質(zhì)工程的互補(bǔ)策略，在抗體設(shè)計(jì)、優(yōu)化和合成生物學(xué)中的應(yīng)用日益增長(zhǎng)�？偟膩�(lái)說(shuō)，最近的策略匯聚在生成式AI框架內(nèi)，可以大致分為三類：語(yǔ)言模型、擴(kuò)散模型和混合模型(圖4)。

·語(yǔ)言模型(例如，Absci, AbGPT, AntiBARTy)在大型抗體序列庫(kù)上進(jìn)行訓(xùn)練，以生成新序列，特別是在高度多樣化的區(qū)域，如CDRH3。

·擴(kuò)散模型細(xì)分為基于結(jié)構(gòu)的(例如，RFdiffusion, DiffDock-A)，它們使用來(lái)自PDB或SAbDab的實(shí)驗(yàn)解析的抗體-抗原復(fù)合物來(lái)設(shè)計(jì)新的3D骨架，然后通過(guò)Protein MPNN進(jìn)行序列優(yōu)化；以及基于序列的(例如，Abdiffuser)，它們利用抗體序列數(shù)據(jù)集與預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)來(lái)生成新序列。

·混合模型(例如，Refine GNN)整合了配對(duì)的序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，使得能夠同時(shí)優(yōu)化序列和結(jié)構(gòu)�？傊�，這些生成框架提供了互補(bǔ)的策略，擴(kuò)展了抗體發(fā)現(xiàn)的領(lǐng)域，并加速了功能性治療候選物的設(shè)計(jì)。

圖4. 使用生成式AI模型生成抗體的示意圖。

生成式AI方法包括語(yǔ)言模型(基于序列的設(shè)計(jì))、擴(kuò)散模型(基于序列或結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的生成)和混合模型(整合序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行同步優(yōu)化)。一個(gè)集成框架將抗體發(fā)現(xiàn)從已發(fā)表的經(jīng)驗(yàn)篩選轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的設(shè)計(jì)。

現(xiàn)在，AI輔助的抗體設(shè)計(jì)已經(jīng)在多種靶點(diǎn)上展示了顯著的通用性，包括病毒蛋白、膜受體致癌蛋白。隨著計(jì)算建模和高通量實(shí)驗(yàn)的融合，從頭抗體生成有望成為一個(gè)由機(jī)器學(xué)習(xí)和結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)驅(qū)動(dòng)的自動(dòng)化、迭代過(guò)程。這種整合有望更快、更精確地開發(fā)治療性抗體，加速在癌癥、傳染病和免疫治療方面的突破，AI輔助的抗體設(shè)計(jì)代表了一種正在重塑抗體發(fā)現(xiàn)的新趨勢(shì)。

07 總結(jié)與展望
本綜述重點(diǎn)介紹了抗體發(fā)現(xiàn)的多種策略，包括雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示庫(kù)、轉(zhuǎn)基因小鼠、單B細(xì)胞分離和從頭合成方法。盡管取得了這些進(jìn)展，但每種抗體發(fā)現(xiàn)方法仍然存在獨(dú)特的挑戰(zhàn)和權(quán)衡。雜交瘤方法受限于物種特異性免疫反應(yīng)，如免疫耐受，而噬菌體展示可能引入庫(kù)偏差并丟失天然抗體配對(duì)。轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)成本高昂，單B細(xì)胞技術(shù)面臨通量和數(shù)據(jù)解釋的限制。此外，當(dāng)前AI驅(qū)動(dòng)和從頭計(jì)算設(shè)計(jì)方法仍然難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)抗體折疊、動(dòng)力學(xué)和功能功效，強(qiáng)調(diào)了在下一代抗體開發(fā)中需要整合、多平臺(tái)策略。此外，除了這五種抗體生成策略，生產(chǎn)后工程如Fc修飾、半衰期延長(zhǎng)和糖工程也持續(xù)增強(qiáng)抗體的功效、穩(wěn)定性和治療指數(shù)。這些創(chuàng)新補(bǔ)充了發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，將抗體生成與臨床優(yōu)化連接起來(lái)，用于下一代生物制劑。綜上所述，總結(jié)了五種主要的抗體生成方法，這些方法正在擴(kuò)展治療性抗體發(fā)現(xiàn)的邊界，提供了加速開發(fā)過(guò)程并增強(qiáng)人類疾病治療功效的創(chuàng)新策略�？偟膩�(lái)說(shuō)，這些平臺(tái)不僅能夠快速生成傳統(tǒng)的中和抗體，還能生成調(diào)節(jié)信號(hào)通路和驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分化的功能性激動(dòng)劑。新興的方法，如基于自分泌和基于遷移的選擇、體內(nèi)功能性篩選和形態(tài)學(xué)引導(dǎo)的分析，進(jìn)一步擴(kuò)展了抗體發(fā)現(xiàn)的潛力，特別是在癌癥和免疫學(xué)領(lǐng)域。這些進(jìn)展提供了強(qiáng)大的手段來(lái)靶向病毒、腫瘤和免疫受體，同時(shí)也為受體多效性和細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控提供了新的見解。從頭設(shè)計(jì)，越來(lái)越多地與AI驅(qū)動(dòng)的建模和高通量篩選相結(jié)合，代表了一種正在重塑抗體發(fā)現(xiàn)的新趨勢(shì)。展望未來(lái)，這些方法與下一代計(jì)算工具的融合將加速跨傳染病、腫瘤學(xué)及其他領(lǐng)域的創(chuàng)新治療性抗體的開發(fā)。