肉類顏色測量指南之肉色研究方法K-P
K.骨骼肌提取物對肌紅蛋白的還原作用
原則
肌紅蛋白還原酶活性通過監(jiān)測MMb還原為DMb的過程來測定，隨后在有氧體系中快速生成OMb。
酶活性的計算依據(jù)是反應初始線性階段（1至2分鐘）期間OMb在580 nm波長處吸光度的增加。
操作步驟
1. 取5克（稱重至0.1克）不含可見脂肪或結締組織的肌肉組織樣本，將其切成小塊。
2. 將樣品在20 mL的0.2 mM磷酸鈉緩沖液（pH 5.6）中均質(zhì)化（或肌肉的pH值)持續(xù)90秒，或直至肌肉組織完全破壞。
3. 在 4°C 下使用Beckman超速離心機以35,000× g 離心30分鐘。
4. 將上清液倒入小燒杯中，用0.4微米注射器濾器過濾2-3 mL，轉移至小試管中。
5. 配制試驗溶液：
5 mM EDTA二鈉
50 mM檸檬酸鈉緩沖液pH 5.65（將此pH調(diào)整至所需pH）
3.0 mM鐵氰化鉀
0.75 mM甲基肌紅蛋白（馬骨骼肌來源，貨號Sigma M-0630，或經(jīng)純化處理的豬/牛來源，
詳見純化方案）溶于30 mM磷酸鈉緩沖液
1.0 mM NADH（Sigma N-8129）
6. 打開日立UV-2010分光光度計并預熱10分鐘。
7. 如果可能，加載一個分光光度法軟件程序， 該程序可在180至240秒內(nèi)測量580 nm處的吸光
度增加 ； 否則手動加載軟件 。
8. 將空比色皿放入分光光度計比色皿中，并將儀器歸零。
9. 向塑料微孔板中加入以下試劑量：
100 µL 5 mM EDTA
100 µL 50 mM檸檬酸鹽緩沖液
100 µL 3.0 mM鐵氰化鉀
200 0.75 mM甲基肌紅蛋白的 µL 值
200 µL 去離子水
10. 將每個微量比色皿放入分光光度計比色皿中，同時加入
100 1 mM NADH的 µL 值
200 µL 過濾后的肌肉提取物
11. 用移液管充分混勻，然后至少釋放兩次溶液。
注意：加入試劑并盡快混合，因為反應會立即開始。
12. 盡快開始在580 nm處測量吸光度增加，并持續(xù)進行
180至240秒。隨著肌紅蛋白被肌肉提取物還原，吸光度在580 nm會增加。
14. 肌紅蛋白還原酶活性的表達方式為：在時間進程的初始線性階段（通常為 第一或前
兩分鐘），每分鐘每克肌肉中還原的肌紅蛋白納摩爾數(shù)。
樣例
如果0秒時580 nm處的吸光度為0,60秒時吸光度為0.132，則 Δ Abs580nm= 0.132/分鐘。使用比爾定律計算 甲基肌紅蛋白到氧合肌紅蛋白 的濃度變化。
A = Ebc，其中
A=吸光度（或吸光度變化）
b=路徑長度（塑料微孔板為1 cm）
E=消光系數(shù)（12000）C = 濃度（mol/L） / 升 0.132=12000×1×c
c = 0.132/12000
c = 11.0 × e-6 M/分鐘/5克肌肉或11 µM /分鐘/5克肌肉
記下
記住，這里說的是濃度變化，而不是濃度本身。
將濃度變化乘以比色皿中的體積，即可將濃度換算為摩爾。
11 e-6 mol/L/分鐘/5克 × 0.0015升 =
16.5×10^-9摩爾/分鐘/5克肌肉=
16.5 nmol每分鐘/5克肌肉=
3.3 nmol/分鐘/克肌肉
每分鐘每克肌紅蛋白的還原量為3.3 nmol，即為報告數(shù)值
記下
如果將吸光度的變化取120秒（2分鐘）的平均值，然后將最終數(shù)值 除以2 。
參考文獻
Hagler，L.，R. I. Coppes Jr.，和 R. H. Herman. 1979 . 甲基肌紅蛋白還原酶. J. Biol. Chem. 254：6505—6514.
Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影響牛肉肌肉的顏色、高鐵肌紅蛋白還原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 -942。
Mohan，A.，M. C. Hunt，T. J. Barstow，T. A. Houser和D. M. Hueber. 2010a. 通過近紅外血氧測定法檢測三種后強直期骨骼肌中肌紅蛋白的氧化還原形態(tài)。Food Chem. 123 ：456—464。
L.檢測變性血紅蛋白血色素的反射率
原則
變性珠蛋白血紅素色素的存在可通過528和558納米處的反射峰來判斷（Ghorpade和Cornfor
th，1993）。
材料和設備
1. 白色標準品（硫酸鋇粉末）
2. 配備樣品和標準品接口的記錄型分光光度計及積分球附件。
3. 透明聚乙烯真空袋（1.5 mil厚度）。
操作步驟
1. 使用白色標準品（粉狀硫酸鋇）在樣品和標準 端口的反射附件中，將記錄分光光度計的反射率從420至700nm標準化為100%。
2. 獲得3 cm × 3 cm的均勻肉片（足以完全覆蓋反射附件上的樣品端口），厚度>3 mm。
3. 為排除空氣和減少褪色，將新鮮切片迅速放入透明聚乙烯 真空袋（厚度 1 . 5mil）中。 從底部向上壓緊袋子以 消除氣泡。 測量反射率時 ，樣品仍留在透明聚乙烯袋中。
4. 將裝袋樣品緊密放入反射率球的樣品口，使新鮮切片的表面朝內(nèi)（即朝向檢測器）。記錄420至700納米波長范圍內(nèi)的表面反射率（以標準值百分比表示）。變性珠蛋白血紅素色素的存在可通過528和558納米附近出現(xiàn)反射率峰值來判斷（戈爾帕德和康福斯 ， 1986 ； 康福斯 ， 2001）。
5. 可選:若需獲取新鮮樣本與褪色樣本的差異光譜,可將對照組肉片置于空氣中褪色15至30分鐘。
6. 將樣品裝入袋中，按新鮮樣品的描述記錄反射光譜。
7. 從新鮮樣本光譜中減去基線光譜（褪色切片）。
參考文獻
Cornforth，D. P. 2001. 熟肉與腌制肉色素的分光光度法及反射率測定。收錄于《食品分析化學最新實驗指南》F3.2單元，由S. J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.出版社，紐約。
Ghorpade，V. M.和D. P. Cornforth. 1993 .在65°C或82°C下烹制的豬肉烤制過程中產(chǎn)生粉紅色的色素的光譜。J. Food Sci. 58：51-52,59。
M. nitrite熟肉分析
原則
亞硝酸鹽離子被溶入熱水中。取部分提取液與格里斯試劑（硫酰胺+N-（1-萘基）乙二胺）混合，生成最大吸光度為540 nm的粉紅色偶氮染料。 粉紅色調(diào)的深淺 與 初始亞硝酸鹽濃度（按比爾定律）成正比。 樣品亞硝酸鹽濃度通過亞硝酸鹽標準曲線計算 ，并考慮樣品稀釋倍數(shù)。
試劑和儀器
1. NED試劑：將0.2 g N -（1-萘基）乙二胺-2-HCl溶于150 mL 15%（v/v）乙酸中，必要時過
濾，儲存在棕色玻璃瓶中。
2. 磺胺試劑：取0.5克磺胺溶于150毫升15%（體積分數(shù)）乙酸中，必要時過濾，置于棕色
玻璃瓶中保存。
3. 亞硝酸鹽標準：
a. 貯備液：亞硝酸鈉1000ppm。取亞硝酸鈉1.0g溶于水，稀釋至1L。
b. 中間溶液：100 ppm亞硝酸鈉。取100 mL原液，加水稀釋至1 L。
c. 工作溶液：1 ppm亞硝酸鈉。取10 mL中間體溶液，用水稀釋至1 L。
4. 取3-4張濾紙，分析盒中濾紙的亞硝酸鹽污染情況。 通過每張濾紙過濾約40mL水 。 加入4mL磺胺類試劑，攪拌，靜置5分鐘，加入4毫升NED試劑，混合后靜置15分鐘。若檢測到陽性結果，請丟棄整盒。
操作步驟
1. 稱取5克細碎組織，將樣本充分混勻后置于50毫升燒杯中。
2. 加入約40mL80℃水，用玻璃棒充分混勻，破碎所有塊狀物， 并轉移至500 - mL容量瓶中。
3. 用熱水分次清洗燒杯和棒，將所有洗液倒入燒瓶中。
4. 加入足量熱水，使體積達到約300mL，將燒瓶轉移至80°C 水浴 中，并靜置2小時，偶爾搖動。
5. 冷卻至室溫，用水稀釋至體積，并再次混合。
6. 過濾，向50-50mL容量瓶中含5至50µg亞硝酸鈉的等分試樣中加入2.5mL磺胺類試劑，并混合。
7. 5分鐘后，加入2.5 mL NED試劑，混合，稀釋至體積，再次混合， 15分鐘內(nèi)顯色 。
8. 將溶液轉移至分光光度計比色皿中，以含45mL水、2.5mL磺胺類試劑和2.5mLNED試劑的空白溶液為對照，測定 540nm 處的吸光度。
9. 制備標準曲線：向50毫升容量瓶中分別加入10、20、30和40毫升工作硝酸鈉溶液，加入2.5毫升磺胺類試劑，混勻后按上述步驟進行，從步驟7開始。最終溶液中硝酸鈉濃度為1ppm時，標準曲線呈直線。
計算
樣品中NaNO的ppm2（µg NaNO2/g樣品）=標準曲線給出的ppm NaNO2×50/分裝量（mL）×500/樣品重量(g)
參考
AOAC . 1990. 《熟肉中亞硝酸鹽的測定方法973.31》，載于《官方分析方法》第15版，K. Helrich主編，弗吉尼亞州阿靈頓： AOAC 出版社，第938頁。
n. 烤肉及配料的硝酸鹽分析
原則
亞硝酸鹽和硝酸鹽離子需用熱水提取。
初始亞硝酸鹽濃度通過與格里斯試劑反應后產(chǎn)生的粉紅色（540nm 波長）強度測定，具體方法如先前所述。測定硝酸鹽+亞硝酸鹽時，將樣品提取液與釩（III）溶液+格里斯試劑混合孵育。
酸性溶液中的釩可將所有硝酸鹽離子還原為亞硝酸鹽。隨著亞硝酸鹽生成，其會與預先存在的亞硝酸鹽一同被格里斯試劑捕獲。
硝酸鹽濃度=總亞硝酸鹽（釩測定法中硝酸鹽+亞硝酸鹽的總和）-初始亞硝酸鹽。
該方法經(jīng)過改良，將釩+格里斯試劑合并為單一溶液，并改用分光光度計比色皿進行檢測。
程序（NEMI ，2011）
1. 將約200 mL 0.5 M鹽酸倒入一個小瓶中。
2. 將瓶子置于帶通風罩的天平上，直接稱取約0.5g三氯化釩（III）放入瓶中（為避免其粘附在鏟
子、稱量器等上）。如果仍有未溶解的顆粒殘留，通過>2微米注射器過濾器進行過濾。
3. 加入約0 . 2g磺胺和0 . 01g N -（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽（NED）并溶解。
記下
將打開的VCl瓶 3 放置在無水硫酸鈣等干燥劑上。VCl在潮濕空氣中會 3 釋放腐蝕性氣體，但在試劑中溶解后 將不再釋放氣體。 氯化釩不被歸類為有毒或?qū)Νh(huán)境有害（MSDS 數(shù)據(jù)），與舊方法中使用的鎘不同。
VCl 3 + Greiss試劑溶液冷藏可保存約一周，但對空氣和光線敏感，若在室溫下放置數(shù)日且未加蓋，易被氧化。
將以下體積的樣品和試劑直接混合在半微量比色皿中，或按所用儀器的細胞大小進行比例調(diào)整。
對于1至20ppm（µg /mL）硝酸鹽氮，將20 µ L樣品與1000 µL 試劑混合。
對于1至10ppm硝酸鹽氮，使用45 µL 樣品和1000 µL 試劑。
當硝酸鹽氮含量低于1 ppm時，使用500 µL 樣品和500 µL 試劑（注：1,000 µL =1 mL）。
（如果新批次樣品的濃度完全未知，可通過篩選幾個代表性樣品快速估計其濃度范圍。將等量樣品與試劑混合。對幾個標準品也做同樣的處理。在烘箱或熱水下對樣品進行短暫加熱 。通過比較顏色來決定最佳濃度范圍。）
將樣品移入半微量比色皿，隨后向所有比色皿中加入試劑。蓋上蓋子，輕輕倒置以充分混合。
樣品需在室溫（20-25℃）條件下保存。顯色反應在4-5小時后逐漸減弱，6-10小時后達到峰值。比色測定需以試劑空白（水）為對照，在 540nm 波長下進行。建議將標準品與樣品共同分析，以便建立校準曲線用于濃度計算。雖然4-5小時后即可進行測量，但為確保準確性，建議次日制備樣品并測定吸光度。
顏色可能可在60 ℃ 下約2小時內(nèi)顯色， 或?qū)悠坊旌嫌谛≡嚬苤?nbsp;，在約100℃下加熱10至15分鐘，使顏色完全顯色。
肉類樣品的制備采用與亞硝酸鹽測定相同的熱水萃取法。計算硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度時，需考慮樣
品的稀釋倍數(shù)。
該方法經(jīng)過輕微調(diào)整，具體說明可參見 NEMI 官網(wǎng)（NEMI ，2011）。
參考文獻
多恩，T. A.和W. R. Horwath. 2003 .用單一試劑測定硝酸鹽的分光光度法。分析。
Lett .36：2713—2722。
NEMI（國家環(huán)境方法索引）。2011。國家環(huán)境方法索引。2011。 https:// www.nemi.gov/ 。
o. t BARS氧化酸敗檢測法——快速濕法
原則
在硫代巴比妥酸（TBA）存在下，丙二醛和脂質(zhì)氧化的其他醛類產(chǎn)物（TBA反應物質(zhì)； TBARS）會形成 粉色顯色劑，其最大吸收峰位于532至535 nm 。 然而 ， 在干擾性糖類存在時 ， 會形成黃色顯色劑 ， 采用Tarladgis（1960）蒸餾法 可避免此現(xiàn)象。
試劑
1. TBA貯備液：0.375%硫代巴比妥酸、15%三氯乙酸和0.25 N 鹽酸 。
2. 100mL貯備液足以進行20次單獨檢測。貯備液可在室溫下避光保存（封裝于鋁箔包裝容器中）。
操作步驟
1. 將目標產(chǎn)物切碎或絞碎，稱取兩份0.5克樣品。
2. 向每個樣品中加入2.5 mL TBA貯備液，使稀釋倍數(shù)為6�；靹颉�
3. 將樣品置于沸水中加熱10分鐘，使用松蓋試管（圓底Pyrex 或聚丙烯離心管）。 注意： 密封蓋試管在加熱過程中可能爆裂。加熱過程中陽性樣品會變成粉色。
4. 用自來水冷卻試管。
5. 在4 °C 下以5000× g 離心10分鐘，獲得澄清上清液。
6. 小心地將上清液的一部分移至分光光度計比色皿中，注意溶液保持澄清。
7. 在532 nm處測定上清液吸光度，空白對照為 含有所有試劑 ， 但不含肉的溶液。
8. 使用 粉色TBA顯色劑的消光系數(shù) 1.56×10^5 56×10^5 56 / M / cm（Sinnhuber和Yu1958），
計算以ppm丙二醛表示的TBA值 ， 具體方法如下 ：
TBARS數(shù)值（mg MDA/kg）=樣品A532×（1M TBA顯色劑/156，000）×[（1mol/L/M]×（0.003L/0.5g肉）×（72.07gMDA/mol MDA）×1000mg/g）×1000g/kg)，
或TBARS 值（ppm）= 樣品A A 532 ×2.77 。
參考文獻
Buege，J. A.和S. D. Aust. 1978 .微粒體脂質(zhì)過氧化.方法酶學.52： 302 — 304 .
Sinnhuber，R. O.和T. C. Yu .1958. 2 - 魚類制品酸敗度的硫代巴比妥酸法測定 .II.丙二醛的定量測定.食品技術.12：9—12.
P.t BARS氧化酸敗檢測法——蒸餾法
原則
該方法中，將樣品置于水中加熱，通過蒸汽蒸餾收集揮發(fā)性丙二醛及其他TBA反應物（TBARS）。向 蒸餾液等分試樣中加入TBA溶液，形成粉紅色TBA顯色劑 ， 通過分光光度法進行定（Tarladgis等人 ， 1960 ； Koniecko ， 1979）。
解決方案
1. TBA試劑：將1.44 g2-硫代巴比妥酸（分子量144.1）溶于450 mL 冰醋酸 中。 用50 - mL容量瓶定容。 攪拌后，置于暗處（用鋁箔包裝）保存。
2. 磺胺試劑：將1克磺胺溶解于含有40毫升濃鹽酸和160毫升蒸餾水的溶液中。
操作步驟
1. 將10克絞碎或切碎的肉樣與50毫升蒸餾水混合，使用Waring攪拌器。定量轉移至圓底加熱瓶（凱氏瓶），并添加47.5毫升額外水。加入2.5毫升6 N 鹽酸溶液（1,2濃縮鹽酸與水混合）。
2. 為防止碰撞，可添加若干玻璃珠。若加熱時起泡，可加入消泡劑（如陶氏H-10消泡劑或同類產(chǎn)品）。
3. 將燒瓶充分加熱以產(chǎn)生蒸汽。使用水冷凝蒸餾裝置，將50mL蒸餾液收集到量筒中。每份樣品所需時間約為10分鐘。
4. 將蒸餾液充分混勻，用移液管吸取5mL注入50mL帶塞玻璃瓶中，加入5mLTBA 試劑 。
5. 與由5mL蒸餾水和5mLTBA試劑組成的空白混合后，將其與空白一起浸入沸水浴中，精確浸泡35分鐘。
6. 將冷卻后的樣品瓶置于自來水下靜置10分鐘。使用零點校準的分光光度計，在538 nm處測定吸光度，以TBA-水空白為對照。
參考文獻
Koniecko，E. S. 1979. 《肉類化學家手冊》，第53、54和62頁。Avery Publ. Group Inc.，Wayne，NJ。
塞弗特，M.，M.C.亨特，J.P.格羅貝爾，S.M.瑞安，D.E.約翰遜，和R.A.莫德倫.2006.乳酸鉀和新鮮豬肉香腸配方對有光和無光展示貨架壽命的影響。J.Food Sci.71：C390–C394.
塔拉德吉斯、B.G.、B.M.沃茨和M.T.尤納森，1960年�！队糜诙繙y定變質(zhì)食品中丙二醛的蒸餾法》，載于《美國油脂化學學會雜志》第37卷第44–48頁。
原則
肌紅蛋白還原酶活性通過監(jiān)測MMb還原為DMb的過程來測定，隨后在有氧體系中快速生成OMb。
酶活性的計算依據(jù)是反應初始線性階段（1至2分鐘）期間OMb在580 nm波長處吸光度的增加。
操作步驟
1. 取5克（稱重至0.1克）不含可見脂肪或結締組織的肌肉組織樣本，將其切成小塊。
2. 將樣品在20 mL的0.2 mM磷酸鈉緩沖液（pH 5.6）中均質(zhì)化（或肌肉的pH值)持續(xù)90秒，或直至肌肉組織完全破壞。
3. 在 4°C 下使用Beckman超速離心機以35,000× g 離心30分鐘。
4. 將上清液倒入小燒杯中，用0.4微米注射器濾器過濾2-3 mL，轉移至小試管中。
5. 配制試驗溶液：
5 mM EDTA二鈉
50 mM檸檬酸鈉緩沖液pH 5.65（將此pH調(diào)整至所需pH）
3.0 mM鐵氰化鉀
0.75 mM甲基肌紅蛋白（馬骨骼肌來源，貨號Sigma M-0630，或經(jīng)純化處理的豬/牛來源，
詳見純化方案）溶于30 mM磷酸鈉緩沖液
1.0 mM NADH（Sigma N-8129）
6. 打開日立UV-2010分光光度計并預熱10分鐘。
7. 如果可能，加載一個分光光度法軟件程序， 該程序可在180至240秒內(nèi)測量580 nm處的吸光
度增加 ； 否則手動加載軟件 。
8. 將空比色皿放入分光光度計比色皿中，并將儀器歸零。
9. 向塑料微孔板中加入以下試劑量：
100 µL 5 mM EDTA
100 µL 50 mM檸檬酸鹽緩沖液
100 µL 3.0 mM鐵氰化鉀
200 0.75 mM甲基肌紅蛋白的 µL 值
200 µL 去離子水
10. 將每個微量比色皿放入分光光度計比色皿中，同時加入
100 1 mM NADH的 µL 值
200 µL 過濾后的肌肉提取物
11. 用移液管充分混勻，然后至少釋放兩次溶液。
注意：加入試劑并盡快混合，因為反應會立即開始。
12. 盡快開始在580 nm處測量吸光度增加，并持續(xù)進行
180至240秒。隨著肌紅蛋白被肌肉提取物還原，吸光度在580 nm會增加。
14. 肌紅蛋白還原酶活性的表達方式為：在時間進程的初始線性階段（通常為 第一或前
兩分鐘），每分鐘每克肌肉中還原的肌紅蛋白納摩爾數(shù)。
樣例
如果0秒時580 nm處的吸光度為0,60秒時吸光度為0.132，則 Δ Abs580nm= 0.132/分鐘。使用比爾定律計算 甲基肌紅蛋白到氧合肌紅蛋白 的濃度變化。
A = Ebc，其中
A=吸光度（或吸光度變化）
b=路徑長度（塑料微孔板為1 cm）
E=消光系數(shù)（12000）C = 濃度（mol/L） / 升 0.132=12000×1×c
c = 0.132/12000
c = 11.0 × e-6 M/分鐘/5克肌肉或11 µM /分鐘/5克肌肉
記下
記住，這里說的是濃度變化，而不是濃度本身。
將濃度變化乘以比色皿中的體積，即可將濃度換算為摩爾。
11 e-6 mol/L/分鐘/5克 × 0.0015升 =
16.5×10^-9摩爾/分鐘/5克肌肉=
16.5 nmol每分鐘/5克肌肉=
3.3 nmol/分鐘/克肌肉
每分鐘每克肌紅蛋白的還原量為3.3 nmol，即為報告數(shù)值
記下
如果將吸光度的變化取120秒（2分鐘）的平均值，然后將最終數(shù)值 除以2 。
參考文獻
Hagler，L.，R. I. Coppes Jr.，和 R. H. Herman. 1979 . 甲基肌紅蛋白還原酶. J. Biol. Chem. 254：6505—6514.
Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影響牛肉肌肉的顏色、高鐵肌紅蛋白還原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 -942。
Mohan，A.，M. C. Hunt，T. J. Barstow，T. A. Houser和D. M. Hueber. 2010a. 通過近紅外血氧測定法檢測三種后強直期骨骼肌中肌紅蛋白的氧化還原形態(tài)。Food Chem. 123 ：456—464。
L.檢測變性血紅蛋白血色素的反射率
原則
變性珠蛋白血紅素色素的存在可通過528和558納米處的反射峰來判斷（Ghorpade和Cornfor
th，1993）。
材料和設備
1. 白色標準品（硫酸鋇粉末）
2. 配備樣品和標準品接口的記錄型分光光度計及積分球附件。
3. 透明聚乙烯真空袋（1.5 mil厚度）。
操作步驟
1. 使用白色標準品（粉狀硫酸鋇）在樣品和標準 端口的反射附件中，將記錄分光光度計的反射率從420至700nm標準化為100%。
2. 獲得3 cm × 3 cm的均勻肉片（足以完全覆蓋反射附件上的樣品端口），厚度>3 mm。
3. 為排除空氣和減少褪色，將新鮮切片迅速放入透明聚乙烯 真空袋（厚度 1 . 5mil）中。 從底部向上壓緊袋子以 消除氣泡。 測量反射率時 ，樣品仍留在透明聚乙烯袋中。
4. 將裝袋樣品緊密放入反射率球的樣品口，使新鮮切片的表面朝內(nèi)（即朝向檢測器）。記錄420至700納米波長范圍內(nèi)的表面反射率（以標準值百分比表示）。變性珠蛋白血紅素色素的存在可通過528和558納米附近出現(xiàn)反射率峰值來判斷（戈爾帕德和康福斯 ， 1986 ； 康福斯 ， 2001）。
5. 可選:若需獲取新鮮樣本與褪色樣本的差異光譜,可將對照組肉片置于空氣中褪色15至30分鐘。
6. 將樣品裝入袋中，按新鮮樣品的描述記錄反射光譜。
7. 從新鮮樣本光譜中減去基線光譜（褪色切片）。
參考文獻
Cornforth，D. P. 2001. 熟肉與腌制肉色素的分光光度法及反射率測定。收錄于《食品分析化學最新實驗指南》F3.2單元，由S. J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.出版社，紐約。
Ghorpade，V. M.和D. P. Cornforth. 1993 .在65°C或82°C下烹制的豬肉烤制過程中產(chǎn)生粉紅色的色素的光譜。J. Food Sci. 58：51-52,59。
M. nitrite熟肉分析
原則
亞硝酸鹽離子被溶入熱水中。取部分提取液與格里斯試劑（硫酰胺+N-（1-萘基）乙二胺）混合，生成最大吸光度為540 nm的粉紅色偶氮染料。 粉紅色調(diào)的深淺 與 初始亞硝酸鹽濃度（按比爾定律）成正比。 樣品亞硝酸鹽濃度通過亞硝酸鹽標準曲線計算 ，并考慮樣品稀釋倍數(shù)。
試劑和儀器
1. NED試劑：將0.2 g N -（1-萘基）乙二胺-2-HCl溶于150 mL 15%（v/v）乙酸中，必要時過
濾，儲存在棕色玻璃瓶中。
2. 磺胺試劑：取0.5克磺胺溶于150毫升15%（體積分數(shù)）乙酸中，必要時過濾，置于棕色
玻璃瓶中保存。
3. 亞硝酸鹽標準：
a. 貯備液：亞硝酸鈉1000ppm。取亞硝酸鈉1.0g溶于水，稀釋至1L。
b. 中間溶液：100 ppm亞硝酸鈉。取100 mL原液，加水稀釋至1 L。
c. 工作溶液：1 ppm亞硝酸鈉。取10 mL中間體溶液，用水稀釋至1 L。
4. 取3-4張濾紙，分析盒中濾紙的亞硝酸鹽污染情況。 通過每張濾紙過濾約40mL水 。 加入4mL磺胺類試劑，攪拌，靜置5分鐘，加入4毫升NED試劑，混合后靜置15分鐘。若檢測到陽性結果，請丟棄整盒。
操作步驟
1. 稱取5克細碎組織，將樣本充分混勻后置于50毫升燒杯中。
2. 加入約40mL80℃水，用玻璃棒充分混勻，破碎所有塊狀物， 并轉移至500 - mL容量瓶中。
3. 用熱水分次清洗燒杯和棒，將所有洗液倒入燒瓶中。
4. 加入足量熱水，使體積達到約300mL，將燒瓶轉移至80°C 水浴 中，并靜置2小時，偶爾搖動。
5. 冷卻至室溫，用水稀釋至體積，并再次混合。
6. 過濾，向50-50mL容量瓶中含5至50µg亞硝酸鈉的等分試樣中加入2.5mL磺胺類試劑，并混合。
7. 5分鐘后，加入2.5 mL NED試劑，混合，稀釋至體積，再次混合， 15分鐘內(nèi)顯色 。
8. 將溶液轉移至分光光度計比色皿中，以含45mL水、2.5mL磺胺類試劑和2.5mLNED試劑的空白溶液為對照，測定 540nm 處的吸光度。
9. 制備標準曲線：向50毫升容量瓶中分別加入10、20、30和40毫升工作硝酸鈉溶液，加入2.5毫升磺胺類試劑，混勻后按上述步驟進行，從步驟7開始。最終溶液中硝酸鈉濃度為1ppm時，標準曲線呈直線。
計算
樣品中NaNO的ppm2（µg NaNO2/g樣品）=標準曲線給出的ppm NaNO2×50/分裝量（mL）×500/樣品重量(g)
參考
AOAC . 1990. 《熟肉中亞硝酸鹽的測定方法973.31》，載于《官方分析方法》第15版，K. Helrich主編，弗吉尼亞州阿靈頓： AOAC 出版社，第938頁。
n. 烤肉及配料的硝酸鹽分析
原則
亞硝酸鹽和硝酸鹽離子需用熱水提取。
初始亞硝酸鹽濃度通過與格里斯試劑反應后產(chǎn)生的粉紅色（540nm 波長）強度測定，具體方法如先前所述。測定硝酸鹽+亞硝酸鹽時，將樣品提取液與釩（III）溶液+格里斯試劑混合孵育。
酸性溶液中的釩可將所有硝酸鹽離子還原為亞硝酸鹽。隨著亞硝酸鹽生成，其會與預先存在的亞硝酸鹽一同被格里斯試劑捕獲。
硝酸鹽濃度=總亞硝酸鹽（釩測定法中硝酸鹽+亞硝酸鹽的總和）-初始亞硝酸鹽。
該方法經(jīng)過改良，將釩+格里斯試劑合并為單一溶液，并改用分光光度計比色皿進行檢測。
程序（NEMI ，2011）
1. 將約200 mL 0.5 M鹽酸倒入一個小瓶中。
2. 將瓶子置于帶通風罩的天平上，直接稱取約0.5g三氯化釩（III）放入瓶中（為避免其粘附在鏟
子、稱量器等上）。如果仍有未溶解的顆粒殘留，通過>2微米注射器過濾器進行過濾。
3. 加入約0 . 2g磺胺和0 . 01g N -（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽（NED）并溶解。
記下
將打開的VCl瓶 3 放置在無水硫酸鈣等干燥劑上。VCl在潮濕空氣中會 3 釋放腐蝕性氣體，但在試劑中溶解后 將不再釋放氣體。 氯化釩不被歸類為有毒或?qū)Νh(huán)境有害（MSDS 數(shù)據(jù)），與舊方法中使用的鎘不同。
VCl 3 + Greiss試劑溶液冷藏可保存約一周，但對空氣和光線敏感，若在室溫下放置數(shù)日且未加蓋，易被氧化。
將以下體積的樣品和試劑直接混合在半微量比色皿中，或按所用儀器的細胞大小進行比例調(diào)整。
對于1至20ppm（µg /mL）硝酸鹽氮，將20 µ L樣品與1000 µL 試劑混合。
對于1至10ppm硝酸鹽氮，使用45 µL 樣品和1000 µL 試劑。
當硝酸鹽氮含量低于1 ppm時，使用500 µL 樣品和500 µL 試劑（注：1,000 µL =1 mL）。
（如果新批次樣品的濃度完全未知，可通過篩選幾個代表性樣品快速估計其濃度范圍。將等量樣品與試劑混合。對幾個標準品也做同樣的處理。在烘箱或熱水下對樣品進行短暫加熱 。通過比較顏色來決定最佳濃度范圍。）
將樣品移入半微量比色皿，隨后向所有比色皿中加入試劑。蓋上蓋子，輕輕倒置以充分混合。
樣品需在室溫（20-25℃）條件下保存。顯色反應在4-5小時后逐漸減弱，6-10小時后達到峰值。比色測定需以試劑空白（水）為對照，在 540nm 波長下進行。建議將標準品與樣品共同分析，以便建立校準曲線用于濃度計算。雖然4-5小時后即可進行測量，但為確保準確性，建議次日制備樣品并測定吸光度。
顏色可能可在60 ℃ 下約2小時內(nèi)顯色， 或?qū)悠坊旌嫌谛≡嚬苤?nbsp;，在約100℃下加熱10至15分鐘，使顏色完全顯色。
肉類樣品的制備采用與亞硝酸鹽測定相同的熱水萃取法。計算硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度時，需考慮樣
品的稀釋倍數(shù)。
該方法經(jīng)過輕微調(diào)整，具體說明可參見 NEMI 官網(wǎng)（NEMI ，2011）。
參考文獻
多恩，T. A.和W. R. Horwath. 2003 .用單一試劑測定硝酸鹽的分光光度法。分析。
Lett .36：2713—2722。
NEMI（國家環(huán)境方法索引）。2011。國家環(huán)境方法索引。2011。 https:// www.nemi.gov/ 。
o. t BARS氧化酸敗檢測法——快速濕法
原則
在硫代巴比妥酸（TBA）存在下，丙二醛和脂質(zhì)氧化的其他醛類產(chǎn)物（TBA反應物質(zhì)； TBARS）會形成 粉色顯色劑，其最大吸收峰位于532至535 nm 。 然而 ， 在干擾性糖類存在時 ， 會形成黃色顯色劑 ， 采用Tarladgis（1960）蒸餾法 可避免此現(xiàn)象。
試劑
1. TBA貯備液：0.375%硫代巴比妥酸、15%三氯乙酸和0.25 N 鹽酸 。
2. 100mL貯備液足以進行20次單獨檢測。貯備液可在室溫下避光保存（封裝于鋁箔包裝容器中）。
操作步驟
1. 將目標產(chǎn)物切碎或絞碎，稱取兩份0.5克樣品。
2. 向每個樣品中加入2.5 mL TBA貯備液，使稀釋倍數(shù)為6�；靹颉�
3. 將樣品置于沸水中加熱10分鐘，使用松蓋試管（圓底Pyrex 或聚丙烯離心管）。 注意： 密封蓋試管在加熱過程中可能爆裂。加熱過程中陽性樣品會變成粉色。
4. 用自來水冷卻試管。
5. 在4 °C 下以5000× g 離心10分鐘，獲得澄清上清液。
6. 小心地將上清液的一部分移至分光光度計比色皿中，注意溶液保持澄清。
7. 在532 nm處測定上清液吸光度，空白對照為 含有所有試劑 ， 但不含肉的溶液。
8. 使用 粉色TBA顯色劑的消光系數(shù) 1.56×10^5 56×10^5 56 / M / cm（Sinnhuber和Yu1958），
計算以ppm丙二醛表示的TBA值 ， 具體方法如下 ：
TBARS數(shù)值（mg MDA/kg）=樣品A532×（1M TBA顯色劑/156，000）×[（1mol/L/M]×（0.003L/0.5g肉）×（72.07gMDA/mol MDA）×1000mg/g）×1000g/kg)，
或TBARS 值（ppm）= 樣品A A 532 ×2.77 。
參考文獻
Buege，J. A.和S. D. Aust. 1978 .微粒體脂質(zhì)過氧化.方法酶學.52： 302 — 304 .
Sinnhuber，R. O.和T. C. Yu .1958. 2 - 魚類制品酸敗度的硫代巴比妥酸法測定 .II.丙二醛的定量測定.食品技術.12：9—12.
P.t BARS氧化酸敗檢測法——蒸餾法
原則
該方法中，將樣品置于水中加熱，通過蒸汽蒸餾收集揮發(fā)性丙二醛及其他TBA反應物（TBARS）。向 蒸餾液等分試樣中加入TBA溶液，形成粉紅色TBA顯色劑 ， 通過分光光度法進行定（Tarladgis等人 ， 1960 ； Koniecko ， 1979）。
解決方案
1. TBA試劑：將1.44 g2-硫代巴比妥酸（分子量144.1）溶于450 mL 冰醋酸 中。 用50 - mL容量瓶定容。 攪拌后，置于暗處（用鋁箔包裝）保存。
2. 磺胺試劑：將1克磺胺溶解于含有40毫升濃鹽酸和160毫升蒸餾水的溶液中。
操作步驟
1. 將10克絞碎或切碎的肉樣與50毫升蒸餾水混合，使用Waring攪拌器。定量轉移至圓底加熱瓶（凱氏瓶），并添加47.5毫升額外水。加入2.5毫升6 N 鹽酸溶液（1,2濃縮鹽酸與水混合）。
2. 為防止碰撞，可添加若干玻璃珠。若加熱時起泡，可加入消泡劑（如陶氏H-10消泡劑或同類產(chǎn)品）。
3. 將燒瓶充分加熱以產(chǎn)生蒸汽。使用水冷凝蒸餾裝置，將50mL蒸餾液收集到量筒中。每份樣品所需時間約為10分鐘。
4. 將蒸餾液充分混勻，用移液管吸取5mL注入50mL帶塞玻璃瓶中，加入5mLTBA 試劑 。
5. 與由5mL蒸餾水和5mLTBA試劑組成的空白混合后，將其與空白一起浸入沸水浴中，精確浸泡35分鐘。
6. 將冷卻后的樣品瓶置于自來水下靜置10分鐘。使用零點校準的分光光度計，在538 nm處測定吸光度，以TBA-水空白為對照。
參考文獻
Koniecko，E. S. 1979. 《肉類化學家手冊》，第53、54和62頁。Avery Publ. Group Inc.，Wayne，NJ。
塞弗特，M.，M.C.亨特，J.P.格羅貝爾，S.M.瑞安，D.E.約翰遜，和R.A.莫德倫.2006.乳酸鉀和新鮮豬肉香腸配方對有光和無光展示貨架壽命的影響。J.Food Sci.71：C390–C394.
塔拉德吉斯、B.G.、B.M.沃茨和M.T.尤納森，1960年�！队糜诙繙y定變質(zhì)食品中丙二醛的蒸餾法》，載于《美國油脂化學學會雜志》第37卷第44–48頁。
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