高速顯微鏡在掃描微量滴定板中的應用
（論文部分內(nèi)容摘抄）
在幾乎所有的細胞培養(yǎng)應用中，定期控制細胞生長和細胞狀態(tài)是至關(guān)重要的。由于細胞的微小尺寸，形態(tài)學評估必須借助顯微鏡。使幾乎透明的細胞可見的一種非常普遍和廣泛的技術(shù)是相差顯微鏡。細胞通常在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)在透明塑料材料例如微量滴定板(MTP)上。這樣的板具有約128mm*85mm包含幾個孔，這是獨立的隔室細胞生長。顯微分析直接在倒置顯微鏡上的這些微量滴定板中進行。
為了更好地了解細胞培養(yǎng)狀態(tài)，對微量滴度板整個孔的整個內(nèi)容物進行成像是有幫助的。這一點尤其正確，因為細胞集落往往更好地在井的邊緣區(qū)域生長。通常需要成像的不僅僅是CTP上的一個孔，而是整個板。由于孔彼此緊密相鄰，因此孔底部區(qū)域幾乎覆蓋了整個板的足跡。因此，在顯微鏡下檢查完全填充的微量滴度板意味著成像面積約1萬平方毫米。由于顯微鏡的視場很小，根據(jù)放大倍數(shù)和相機芯片尺寸的不同，其尺寸可小于或最大為幾平方毫米，因此需要成千上萬個單個采集器才能完成如此大的物體。當使用10倍物鏡和2/3的標準尺寸相機芯片時需要近19,000張單獨的圖像。隨后將單個圖像拼接在一起，形成具有微觀分辨率的單個井的分類概覽圖像。在微觀上獲得大面積的問題是所需的時間通常很長。在基于實驗室的細胞培養(yǎng)工作中，這可能是耐受性在大規(guī)模生產(chǎn)過程中，這是一個嚴重的問題。當每天必須對數(shù)以百計的微滴度板進行掃描，以便在自動化設(shè)備中進行工藝和質(zhì)量控制時，高通量的微滴度顯微鏡是不可或缺的。
技術(shù)現(xiàn)狀：
所需的掃描時間主要受圖像數(shù)量和每幅圖像采集時間的影響。增加視場只能略微減少圖像數(shù)量。用更大的攝像頭傳感器。然而，這實際上僅限于4/3“因為大多數(shù)顯微鏡的光學器件不能使超過該尺寸的傳感器不發(fā)光。
獲取時間主要受定位時間的限制，定位時間比傳感器的實際曝光時間長得多�，F(xiàn)代全自動顯微鏡使用電動載物臺，在成像之前對物體進行定位。然后，工作臺移動到下一個位置，并在拍攝下一個圖像之前再次停止。這個過程在整個中期計劃中重復了幾千次。為了應付不確定的位置，分開的位置是通常偏移小于視野的尺寸混合算法隨后使用該重疊將這些圖塊與精確的縫合結(jié)果相匹配。這進一步增加了所需的圖像數(shù)量。但主要的挑戰(zhàn)仍然是定位時間，這是成千上萬單收購的總時間。因此，短的定位時間對于微板的快速掃描是必要的。雖然階段的加速、減速和速度可以調(diào)節(jié)到一定程度，但是由于液體培養(yǎng)基在突然移動時會發(fā)生抖動，這些參數(shù)的提高受到了限制。介質(zhì)的抖動會引起水柱高度的變化，從而減弱傳送到傳感器的光線。這嚴重地降低了縫合圖像的圖像質(zhì)量，因為單塊瓷磚以不同的亮度出現(xiàn)，使得整個圖像非常不協(xié)調(diào)和硬。用自動圖像處理方法處理。這就是為什么平滑的加速值和等待時間在單個圖像之間當使用最先進的顯微鏡進行MTP掃描時，捕獲器是必不可少的。可實現(xiàn)的幀速率實際上被限制在1-2fps。因此，即使在常規(guī)顯微鏡上以相對較小的4倍放大率成像整個微滴板也需要長達20分鐘的時間。顯而易見，先進的顯微鏡無法提供自動化細胞培養(yǎng)檢查所需的吞吐量。
焦點測量與調(diào)整：
清晰獲取的先決條件是在觀察過程中物體位于焦平面內(nèi)。雖然粘附細胞——顧名思義，粘附在微滴定板的透明底部，但它們并不位于一個完全均勻的平面上。注塑成型工藝對板底的幾何變形約為200微米這遠遠超過了顯微鏡物鏡所能承受的景深。因此，板到透鏡的距離有在掃描過程中不斷修正。一個很常見的方法來確定正確的工作距離是根據(jù)特定的標準(即清晰度)比較在不同距離拍攝的多個圖像。這種基于圖像處理的自聚焦過程不僅耗時長，而且要求被測物體在測量過程中不能移動。這就是為什么只有少數(shù)位置是用這種方法測量的，而整個焦點圖是用插值計算的。目前一種基于硬件的聚焦測量方法正在開發(fā)中，它將允許實時測量每個聚焦位置，即使是在舞臺運動中。在對焦點進行測量之后，利用具有300微米運動范圍的同步壓電z級實現(xiàn)對焦點位置的調(diào)整。
下一步，高速采集方法將擴展到熒光顯微鏡。如果成功的話，這種廣泛使用的顯微技術(shù)也將受益于速度的顯著提高。
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