2026年1月5日，中南大學謝輝、饒珊珊、陳春媛共同通訊在Nature Aging（IF=19.5）在線發(fā)表題為“Brain neuron-derived WDFY1 induces bone loss”的研究論文。文中提到大腦健康與骨骼穩(wěn)態(tài)密切相關，骨骼衰老的特征是骨形成不足和骨髓脂肪堆積，但大腦是否會導致這種失衡尚不明確。此前研究雖發(fā)現(xiàn)腦源性因素參與骨重塑，且精神或神經系統(tǒng)疾病患者更易患骨質疏松，但自然衰老的大腦是否通過腦 - 骨軸調控，參與破壞骨微環(huán)境、誘導骨髓間充質干細胞（BMSCs）異常向脂肪細胞分化，進而引發(fā)骨質疏松，仍缺乏相關證據。

基于此，本研究旨在探究以下核心問題：一是衰老大腦來源的細胞外囊泡（AB-EVs）是否會對骨骼代謝產生影響，引發(fā)骨 - 脂肪失衡；二是若存在上述影響，AB-EVs 中發(fā)揮關鍵作用的功能因子是什么；三是該功能因子調控骨骼代謝的具體分子機制；四是通過干預該調控通路，能否改善年齡相關的骨流失和骨質疏松，為臨床防治骨骼衰老相關疾病提供新靶點和新思路。

1、研究方法
1 細胞外囊泡（EVs）的分離與鑒定
從不同年齡和基因型小鼠的腦組織中分離年輕大腦來源 EVs（YB-EVs）、衰老大腦來源 EVs（AB-EVs）及對應非 EV 組分，通過透射電子顯微鏡觀察形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析（NTA）檢測粒徑和濃度，Western blotting 驗證 CD9、CD63 等外泌體標志物的表達，排除非 EV 蛋白污染。同時，從老年和年輕人類供體血漿中分離血漿 EVs（Pla-EVs），用于后續(xù)功能驗證。

2 動物模型構建與處理
構建多種基因工程小鼠模型，包括 Wdfy1 條件性敲除小鼠（Wdfy1fl/fl）、Rab27b 條件性敲除小鼠（Rab27bfl/fl），并與 Map2-CreERT2 或 Camk2a-CreERT2 小鼠雜交，獲得神經元特異性敲除 Wdfy1 或 Rab27b 的小鼠；構建 Tlr3-/- 和 Tlr4-/- 小鼠，用于探究信號通路依賴性。通過腦室內注射、海馬注射、靜脈注射等方式，給予小鼠 AAV 載體（過表達或沉默 Wdfy1）、EVs、重組 WDFY1 蛋白或 RVG-9R 介導的 siWdfy1 等干預，設置不同性別和年齡組，持續(xù)干預后檢測骨骼相關表型。

3 細胞實驗
分離小鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）和 RAW264.7 破骨前體細胞，進行成骨分化、成脂分化和破骨分化誘導。通過 Alizarin Red S（ARS）染色檢測成骨鈣結節(jié)形成，Oil Red O（ORO）染色檢測成脂脂質積累，TRAP 染色鑒定破骨細胞。利用 siRNA 沉默目標基因（如 Vps29、Vps26a、Ctsd 等），或轉染重組質粒，探究分子機制。

4 檢測與分析技術
采用 microcomputed tomography（μCT）分析骨骼微觀結構參數(shù)（如骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)量等）；三點彎曲試驗檢測股骨力學強度；免疫染色（OCN、perilipin 等）檢測成骨細胞和脂肪細胞數(shù)量；qRT-PCR 檢測成骨、成脂相關基因表達；ELISA 檢測血清中骨代謝標志物（OCN、CTX-I）、炎癥因子及 WDFY1 蛋白水平；蛋白質組學分析 EVs 中差異表達蛋白；免疫共沉淀（Co-IP）和 pull-down 實驗驗證蛋白相互作用；免疫熒光染色觀察蛋白定位與共定位。

5 生物信息學分析
重新分析公共單細胞 RNA 測序（snRNA-seq）數(shù)據集，鑒定大腦中 Wdfy1 高表達的細胞類型，量化不同年齡組中 Wdfy1 陽性細胞比例。

2、研究內容
1 AB-EVs 誘導骨 - 脂肪失衡并改變 BMSC 分化命運
透射電子顯微鏡下，YB-EVs 與 AB-EVs 均呈現(xiàn)典型的球形或杯狀結構，納米顆粒追蹤分析檢測二者粒徑相近，且均表達外泌體特征標志物。經 DIR 標記的 EVs 經腦室內或靜脈注射后，可在小鼠骨骼等多個器官檢測到熒光信號；Map2-CreERT2; Cd63 報告小鼠實驗證實，生理條件下神經元來源的 EVs 可進入骨骼組織。4 月齡年輕小鼠經靜脈注射 AB-EVs 后，骨小梁相關骨微結構指標顯著降低，股骨力學強度下降，成骨細胞數(shù)量減少，骨髓脂肪細胞增多，破骨細胞的數(shù)量與活性均顯著增強；15 月齡老年小鼠注射 AB-EVs 后，骨流失與骨髓脂肪堆積的表型進一步加重。體外實驗結果顯示，AB-EVs 可顯著抑制 BMSCs 的成骨分化、促進其成脂分化，人類老年血漿來源的 EVs 也呈現(xiàn)出一致的調控效應。

圖1 | AB-EVs誘導骨-脂肪失衡并改變 BMSC 分化命運。

2 WDFY1 是 AB-EVs 中調控骨代謝的關鍵蛋白
蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)，AB-EVs 與 YB-EVs 存在多種差異表達蛋白，其中 WDFY1 在 AB-EVs 中呈顯著上調趨勢。qRT-PCR 與 Western blotting 實驗證實，老年小鼠大腦組織中 Wdfy1 的 mRNA 與蛋白表達水平均顯著升高，且骨髓組織中 WDFY1 蛋白表達也同步升高，提示骨髓中的 WDFY1 可能由大腦轉運而來。體外實驗顯示，重組 WDFY1 蛋白可直接抑制 BMSCs 成骨分化、促進其成脂分化，下調成骨相關基因表達，上調成脂相關基因表達，且對破骨細胞分化存在劑量依賴性調控作用。ELISA 檢測發(fā)現(xiàn)，老年小鼠的血清及血清 EVs 中 WDFY1 水平均顯著升高，人類老年血漿及血漿 EVs 中 WDFY1 表達水平隨年齡增長呈上升趨勢，且與骨密度呈負相關關系。
 

圖2 | 抗成骨與促脂肪生成蛋白WDFY1在AB-EVs中富集，且與骨密度（BMD）呈負相

3 大腦 WDFY1 通過 EVs 介導調控骨 - 脂肪失衡
年輕小鼠經腦室內注射 AAV2-Wdfy1 過表達載體后，出現(xiàn)骨量減少、骨力學強度下降，成骨細胞減少、脂肪細胞增多，且組織中炎癥因子水平升高的表型；而老年小鼠經腦室內注射 AAV2-shWdfy1 沉默載體后，骨骼的衰老相關表型得到顯著改善。從 Wdfy1 沉默小鼠中分離的 AB-EVs，其 WDFY1 蛋白含量顯著降低，對 BMSCs 成骨、成脂分化的調控作用也隨之減弱。直接向小鼠骨髓內注射 WDFY1 蛋白，或靜脈注射過表達 Wdfy1 小鼠的血清 EVs，均可誘導年輕小鼠出現(xiàn)骨流失與骨髓脂肪堆積的表型。在小鼠海馬部位注射 Wdfy1 過表達或沉默載體，也觀察到相似的骨骼表型改變，證實大腦（尤其是海馬區(qū)）來源的 WDFY1 可通過 EVs 轉運至骨骼，進而調控骨代謝與骨 - 脂肪平衡。
 

圖3 | WDFY1基因在腦部促進骨-脂肪失衡并介導AB-EVs對 BMSC 分化的影響

4 神經元 Wdfy1 缺失或抑制神經元 EV 釋放改善骨骼衰老
單細胞核 RNA 測序與免疫熒光染色實驗證實，WDFY1 主要在老年小鼠大腦的 MAP2 陽性神經元中高表達，其中海馬與大腦皮層的 CAMK2A 陽性神經元為主要表達部位。構建神經元特異性 Wdfy1 敲除小鼠（Map2-CreERT2; Wdfy1fl/fl、Camk2a-CreERT2; Wdfy1fl/fl）后發(fā)現(xiàn)，老年敲除小鼠的骨量與骨力學強度顯著提升，成骨細胞數(shù)量增加，骨髓脂肪細胞減少，組織中炎癥因子水平降低。構建神經元特異性 Rab27b 敲除小鼠以抑制神經元 EV 的釋放，結果顯示其 AB-EV 的產量減少，且 EVs 中 WDFY1 含量降低，小鼠骨骼的衰老相關表型得到顯著改善，其 AB-EVs 對 BMSCs 成骨、成脂分化的調控作用也相應減弱。

圖4 | 神經元Wdfy1缺失或阻斷神經元EV分泌可增加骨量并緩解衰老誘導的骨-脂肪失衡。

5 RVG 介導的腦內 siWdfy1 遞送改善老年小鼠骨骼健康
利用可穿越血腦屏障并靶向神經元的 RVG-9R 肽遞送 siWdfy1，對老年小鼠進行靜脈注射處理后，其海馬神經元中 WDFY1 的表達被顯著抑制，且 RVG-9R-siWdfy1 的抑制效果優(yōu)于對照肽。骨微結構檢測與力學測試結果顯示，RVG-9R-siWdfy1 處理組小鼠的骨量與骨強度顯著升高，成骨細胞數(shù)量增加，骨髓脂肪細胞減少，其 AB-EVs 對 BMSCs 的成骨抑制與成脂促進作用也明顯減弱。
 

圖5 | RVG 介導的siWdfy1腦部遞送可改善老年小鼠骨骼健康。

6 WDFY1 通過 retromer 復合體調控 CTSD 和 PRDX2 回收
蛋白質組學與免疫共沉淀實驗證實，WDFY1 可與 retromer 復合體的核心組分直接結合。利用 siRNA 沉默 retromer 復合體相關基因后，WDFY1 對 BMSCs 成骨、成脂分化的調控作用被顯著抑制。WDFY1 的 WD 結構域缺失突變體喪失了對 BMSC 分化的調控功能，而 FYVE 結構域缺失則對其調控功能無明顯影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，WDFY1 對 Ctsd 和 Prdx2 的基因表達無明顯調控作用，但可通過結合 retromer 復合體，促進二者從內體向高爾基體的回收過程，減少其降解，進而導致兩種蛋白在細胞內積累。利用 siRNA 分別沉默 Ctsd 或 Prdx2 后，可分別削弱 WDFY1 對 BMSCs 的成脂促進或成骨抑制作用。免疫共沉淀實驗顯示，CTSD 可與 retromer 復合體的多種組分結合，PRDX2 也可與 retromer 復合體的特定組分結合。

圖6 | 逆向轉運復合體VPS26A/B-VPS35-VPS29介導WDFY1對骨髓間充質干細胞（BMSCs）的調控作用。

7 WDFY1 的骨損傷作用不依賴 TLR3/4 信號
在 Tlr3 基因敲除與 Tlr4 基因敲除小鼠中，經腦室內注射 AAV2-Wdfy1 過表達載體后，小鼠骨量相關指標仍呈顯著降低趨勢，表明 WDFY1 對骨代謝的調控作用獨立于 TLR3/4 信號通路。

3、創(chuàng)新點
1 揭示衰老大腦神經元 EVs 介導的腦 - 骨調控新通路
首次證實衰老大腦神經元分泌的 EVs 是腦 - 骨軸的關鍵信使，與年輕大腦 EVs 不同，AB-EVs 可通過轉運 WDFY1 蛋白，遠程調控骨骼代謝，誘導骨 - 脂肪失衡和骨質疏松，明確了大腦衰老在骨骼衰老中的主動調控作用，突破了傳統(tǒng)對腦 - 骨通信方式的認知。

2 鑒定 WDFY1 為骨代謝新調控因子
發(fā)現(xiàn) WDFY1 作為此前未被報道的骨代謝調控蛋白，在衰老大腦神經元中高表達，通過 EVs 轉運至骨髓后，發(fā)揮抗成骨、促成脂作用，且其在人類血漿和血漿 EVs 中的水平與骨密度呈負相關，為骨質疏松的診斷提供了潛在生物標志物。

4、啟發(fā)
1 深化腦 - 骨軸研究認知
該研究證實大腦衰老并非被動過程，而是通過 EVs 介導的遠程調控主動參與骨骼衰老，提示在研究骨質疏松等年齡相關骨骼疾病時，需充分考慮大腦狀態(tài)的影響，為從多器官交互角度理解骨骼代謝調控提供了新視角，未來可進一步探索腦 - 骨軸中其他 EVs cargo 的作用。

2 拓展生物標志物與治療靶點范圍
WDFY1 作為與骨密度負相關的蛋白，有望開發(fā)為骨質疏松的診斷生物標志物，尤其適用于老年人群或伴有腦功能衰退的患者。同時，WDFY1、retromer 復合體組分或 CTSD/PRDX2 均可作為骨質疏松治療的潛在靶點，為研發(fā)新型抗骨質疏松藥物提供了明確方向。

參考文獻：Chen CY, Wang Z, Hong CG, Tan YJ, Duan YX, Luo Y, Wang X, Zeng HJ, Luo JY, Wan TF, Yin H, Liu XX, Zhu H, Zhou Y, Wang ZG, He ZH, Hu XY, Hu GW, Lang HL, Wang ZX, Cao J, Rao SS, Xie H. Brain neuron-derived WDFY1 induces bone loss. Nat Aging. 2026 Jan 5. doi: 10.1038/s43587-025-01032-8IF: 19.4 Q1 . Epub ahead of print. PMID: 41491871.

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