流式實(shí)驗(yàn)中需要使用的新的流式抗體或者對(duì)于抗體使用濃度不太清楚時(shí)，就需要進(jìn)行滴度。流式抗體滴定是流式實(shí)驗(yàn)成功、獲得可重復(fù)且準(zhǔn)確數(shù)據(jù)的基石，其主要原理是通過不斷稀釋抗體，找到既能有效結(jié)合目標(biāo)抗原，又能避免非特異性染色的最佳濃度。合理的滴度實(shí)驗(yàn)可以有效的提升信噪比、節(jié)約成本同時(shí)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，保證不同實(shí)驗(yàn)條件（如細(xì)胞類型、實(shí)驗(yàn)方案、溫度等）下最佳抗體使用濃度，獲得最佳使用效果。

一、滴定前準(zhǔn)備

確定滴定范圍：

參考抗體說明書或文獻(xiàn)推薦的起始濃度。若無，可從 0.125 µg/test 到 2-4 µg/test 開始（對(duì)于直接標(biāo)記抗體），通常設(shè)置4-6個(gè)梯度。

準(zhǔn)備樣本：

• 使用與正式實(shí)驗(yàn)相同的樣本類型（如：同種屬的脾細(xì)胞、PBMC、細(xì)胞系等）。

• 樣本應(yīng)包含明確的陽性群體和陰性群體（用于計(jì)算信噪比）。如果目標(biāo)抗原表達(dá)未知，可用已知陽性和陰性的細(xì)胞系或通過刺激/未刺激樣本對(duì)比。

• 準(zhǔn)備足夠的細(xì)胞，每個(gè)濃度點(diǎn)至少需要 5×10^5 - 1×10^6 個(gè)細(xì)胞（考慮設(shè)置復(fù)孔和對(duì)照）。

必要對(duì)照：

• 未染色對(duì)照：只加細(xì)胞，不加抗體。

• 同型對(duì)照：與滴定抗體相同物種、亞型、標(biāo)記物的非特異性抗體，用于設(shè)置電壓和評(píng)估背景。注意：現(xiàn)代流式更推薦使用熒光減一對(duì)照（FMO） 來設(shè)門，尤其是在多色實(shí)驗(yàn)中。
   

示例：滴定小鼠抗人CD3-FITC抗體，建議測試濃度：0.125， 0.25， 0.5， 1.0， 2.0 µg/test。

1. 分配細(xì)胞：取5支流式管，每管加入1×10^6個(gè)細(xì)胞（體積一致，如100µL）。

2. 稀釋抗體：將抗體母液按計(jì)劃梯度稀釋至工作液濃度，確保每管加入的體積一致（例如10µL），并用緩沖液（如含1% BSA的PBS）補(bǔ)足體積至相同。

3. 孵育：按照標(biāo)準(zhǔn)染色流程（避光、4°C或冰上孵育15-30分鐘）。

4. 洗滌與重懸：加入2-3mL染色緩沖液，離心棄上清，用300-500µL緩沖液或固定液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

5. 設(shè)置儀器：先用未染色對(duì)照調(diào)節(jié)所有通道的電壓，使陰性群體落在對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸的10^0-10^1范圍內(nèi)。此后，所有樣本的電壓保持不變！

三、數(shù)據(jù)分析與最適濃度選擇

1. 獲取數(shù)據(jù)：記錄每個(gè)濃度下陽性群體和陰性群體的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。

2. 計(jì)算關(guān)鍵指標(biāo)（任選其一，推薦染色指數(shù)SI）：

• 信噪比（S/N） = 陽性MFI / 陰性MFI

• 染色指數(shù)（SI） = （陽性MFI - 陰性MFI） / （2 × 陰性群體的標(biāo)準(zhǔn)差）

  SI更客觀，因?yàn)樗�考慮了陰性群體的分布寬度。SI值最大時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度通常是最優(yōu)濃度。

3. 繪制曲線：以抗體濃度為X軸（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），SI或S/N為Y軸，繪制曲線。

曲線會(huì)先快速上升（抗體不足區(qū)），然后進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期（最適飽和區(qū)），最后可能緩慢下降（抗體過量導(dǎo)致背景增高）。

4. 選擇最適濃度：

• 理想選擇：選擇平臺(tái)期起始點(diǎn)或平臺(tái)期中段的濃度。例如，如果0.5 µg/test時(shí)SI已達(dá)平臺(tái)期最大值，那么1.0 µg/test并未帶來更好分離，就應(yīng)選擇0.5 µg/test作為工作濃度。

• 實(shí)踐選擇：在平臺(tái)期范圍內(nèi)，有時(shí)會(huì)選擇比理論最優(yōu)濃度稍高一點(diǎn)的濃度，以應(yīng)對(duì)樣本間的小幅差異，確保穩(wěn)定性。

四、注意事項(xiàng)

1. 對(duì)于CD3、CD4、CD8這類分群明顯且間隔非常開的指標(biāo)，只做細(xì)胞性質(zhì)確定設(shè)門用的時(shí)候，可不進(jìn)行滴定，只滴定那些需要分析比例或MFI的指標(biāo)。

2. 樣本狀態(tài)：確保細(xì)胞活性高（>90%），死細(xì)胞會(huì)增加非特異性染色。考慮使用活死染料。

3. 關(guān)于全陽的細(xì)胞的滴定，可以在樣本染色后加入未染色的細(xì)胞；對(duì)于表達(dá)量比較少的稀有細(xì)胞群體，在染色時(shí)，可加入該群細(xì)胞的父級(jí)細(xì)胞群的抗體。

4. 緩沖液：使用含蛋白（如BSA）的染色緩沖液阻斷非特異性結(jié)合。

5. Fc受體阻斷：對(duì)于表達(dá)Fc受體的細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等），務(wù)必在染色前進(jìn)行Fc受體阻斷。

6. 記錄與重復(fù)：詳細(xì)記錄所有使用的濃度、批號(hào)和實(shí)驗(yàn)條件。新批次抗體必須重新滴定，即使貨號(hào)相同。

7. 固定：如果需要固定細(xì)胞，滴定實(shí)驗(yàn)應(yīng)在固定后進(jìn)行，因?yàn)楣潭�可能影響熒光�?qiáng)度。

8. 實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中在一定的細(xì)胞密度范圍內(nèi)，抗體的染色指數(shù)只與抗體的濃度有關(guān)，與細(xì)胞密度無關(guān)。比如染色體系不變，細(xì)胞增加10倍，可以不用增加抗體濃度。

尚恩生物流式抗體產(chǎn)品采用國內(nèi)外高分文獻(xiàn)同樣克隆號(hào)的抗體為原料，進(jìn)口熒光染料通過優(yōu)化工藝高效標(biāo)記，有效保障了流式抗體特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、熒光強(qiáng)度等基礎(chǔ)參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性、認(rèn)可度都同時(shí)得到保障，實(shí)際使用效果不差于進(jìn)口品牌的同類產(chǎn)品。同時(shí)，尚恩生物提供的不僅僅是流式抗體產(chǎn)品，相應(yīng)的專業(yè)配色、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)分析等全流程指導(dǎo)服務(wù)同步在線，有效保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。從產(chǎn)品到服務(wù)，尚恩生物均為您提供最佳選擇，歡迎選購。