基于經(jīng)皮水分流失測量儀評估雪腐鐮刀菌烯醇對AD小鼠皮膚屏障的影響
2024年4月，Tomoki Fukuyama團隊在《Archives of Toxicology》（IF=6.9）期刊上發(fā)表了題為“Sub-acute oral exposure to lowest observed adverse effect level of nivalenol exacerbates atopic dermatitis in mice via direct activation of mitogen-activated protein kinase signal in antigen-presenting cells”的研究論文。該研究探討了霉菌毒素雪腐鐮刀菌烯醇（Nivalenol,NIV）的免疫毒性作用，重點關(guān)注其對抗原呈遞細胞的影響及其在特應(yīng)性皮炎（AD）小鼠模型中的作用。
摘要
本研究使用抗原呈遞細胞和特應(yīng)性皮炎（AD）小鼠模型，調(diào)查了霉菌毒素雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）的免疫毒性作用。體外實驗使用小鼠巨噬細胞系（RAW 264.7）和小鼠樹突狀細胞系（DC 2.4）。細胞暴露于NIV（0.19-5μmol）24小時后，定量檢測了促炎細胞因子（IL-1β、IL-6和TNFα）的產(chǎn)生。為研究炎癥細胞因子產(chǎn)生通路，使用MAPK抑制劑和磷酸化分析，探究了絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路（如ERK1/2、p-38和JNK）在NIV暴露中的可能參與。此外，在半抗原誘導(dǎo)的AD NC/Nga小鼠模型中，評估了低濃度（1或5 ppm）NIV口服暴露的促炎作用。體外實驗表明，暴露于NIV會促進TNFα的產(chǎn)生。此外，使用MAPK抑制劑預(yù)處理后，TNFα的產(chǎn)生受到抑制，這表明NIV直接誘導(dǎo)了MAPK的磷酸化。與對照組相比，口服NIV暴露加劇了AD癥狀，包括耳廓淋巴結(jié)中輔助T細胞和產(chǎn)生IgE的B細胞數(shù)量增加，以及促炎細胞因子（如IL-4、IL-5和IL-13）分泌增多。研究結(jié)果表明，暴露于NIV直接增強了ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化，導(dǎo)致抗原呈遞細胞中TNFα產(chǎn)生增加，這與特應(yīng)性皮炎的發(fā)展密切相關(guān)。
材料與儀器
主要材料：
實驗動物：雌性NC/Nga小鼠（7周齡）。
實驗材料：
雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）、小鼠樹突狀細胞系（DC2.4）、小鼠巨噬細胞系（RAW264.7）、甲苯-2,4-二異氰酸酯（TDI）、抑制劑、抗體、細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、T細胞活化磁珠等。
主要儀器：
酶標(biāo)儀、實時熒光定量PCR系統(tǒng)、流式細胞儀、Western blot成像系統(tǒng)、ASCH VAPO SCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、細胞計數(shù)儀、勻漿儀
實驗過程
體外細胞實驗：
將DC2.4和RAW264.7細胞與不同濃度的NIV（0.19-5μmol/L）共培養(yǎng)24小時。
收集上清液，通過ELISA檢測促炎細胞因子（IL-1β,IL-6,TNFα）的蛋白水平。
提取細胞總RNA，通過qPCR檢測相應(yīng)細胞因子的基因表達水平。
為探究MAPK通路，細胞暴露于NIV 2小時后，通過Western blot檢測ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化水平。
使用特異性MAPK抑制劑（ERK1/2,p38,JNK抑制劑）預(yù)處理細胞1小時，再加入NIV，檢測TNFα的產(chǎn)生情況。
體內(nèi)動物實驗：
使用TDI在NC/Nga小鼠上建立AD模型。小鼠背部皮膚和耳廓每周接受TDI涂抹以誘導(dǎo)AD。
同時，通過飲用水給予小鼠不同劑量的NIV（1 ppm或5 ppm），持續(xù)4周。
實驗期間，每周監(jiān)測AD評分、耳部和背部皮膚厚度，并用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀測量經(jīng)皮水分散失數(shù)據(jù)（TEWL）。4周后，收集小鼠的背部皮膚、耳廓淋巴結(jié)和血清樣本。
ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀
口服NIV使TEWL值上升
制備耳廓淋巴結(jié)單細胞懸液，使用流式細胞術(shù)分析樹突狀細胞（CD11c+CD40+）、輔助T細胞（CD3+CD4+）和B細胞（CD19+IgE+）的數(shù)量變化。
用CD3/CD28抗體磁珠刺激淋巴結(jié)細胞，通過ELISA檢測上清液中Th2型細胞因子（IL-4,IL-5,IL-13）的釋放。
通過ELISA檢測血清總IgE水平。
對皮膚樣本進行H&E染色，進行組織病理學(xué)評估（包括結(jié)痂、增生、細胞浸潤等）。
通過qPCR檢測皮膚組織中IL-4,IL-5,IL-13的基因表達。
實驗結(jié)論
本研究表明，暴露于NIV能直接刺激抗原呈遞細胞的功能。其機制是通過激活MAPK信號通路（ERK1/2,p-38,JNK），促進TNFα的產(chǎn)生。在AD小鼠模型中，口服暴露于接近最低觀察到的不良反應(yīng)水平（LOAEL）的NIV（5 ppm），會增強局部淋巴結(jié)中樹突狀細胞的增殖和Th2型細胞因子（IL-4,IL-5,IL-13）的分泌，從而加劇AD的臨床癥狀、皮膚增厚和皮膚屏障功能損傷。研究結(jié)果提示，NIV可能通過作用于抗原呈遞細胞，成為加劇特應(yīng)性皮炎的潛在環(huán)境因素。
標(biāo)簽：
VAPOSCAN
經(jīng)皮水分流失測量儀
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