在生物制藥層析工藝中，非特異性吸附（Non-specific Binding, NSB）常被視為難以捉摸的工藝干擾。非特異性吸附是目標(biāo)蛋白與填料非預(yù)期位點(diǎn)的結(jié)合、非目標(biāo)蛋白與填料的非預(yù)期結(jié)合的統(tǒng)稱，二者均會(huì)引發(fā)工藝問(wèn)題。其典型表現(xiàn)有：目標(biāo)蛋白收率異常下降、洗脫峰拖尾、雜質(zhì)清除率波動(dòng)等。要真正解決非特異性吸附，必須跳出簡(jiǎn)單的表面現(xiàn)象，深入到分子熱力學(xué)與填料-蛋白質(zhì)界面動(dòng)力學(xué)的層面。

但如果從更深層的物理化學(xué)視角看，在蛋白質(zhì)樣品流經(jīng)層析柱時(shí)，樣品溶液中一個(gè)個(gè)到處自由擴(kuò)散的蛋白質(zhì)，并沒(méi)有長(zhǎng)眼睛，根本不會(huì)“認(rèn)識(shí)”所處的周圍的填料是親和型的，還是離子型的，抑或是多模式型的，更不會(huì)據(jù)此提前做好準(zhǔn)備去結(jié)合填料。填料的這些分類，只是我們基于使用方便、結(jié)合一定的科學(xué)性給予的定義，樣品中的蛋白質(zhì)并不會(huì)提前知道我們用什么樣的填料去吸附他們。那么，在本質(zhì)上，蛋白質(zhì)是怎么吸附到填料上的呢？

分子熱力學(xué)告訴我們，特異性吸附本質(zhì)上是目標(biāo)蛋白質(zhì)與填料特異性位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，吉布斯自由能（ΔG）下降的體現(xiàn)。而同理，非特異性吸附的熱力學(xué)本質(zhì)為非目標(biāo)蛋白與填料任意位點(diǎn)、目標(biāo)蛋白與填料非預(yù)期位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，吉布斯自由能（ΔG）下降的體現(xiàn)，二者均是體系自發(fā)的熱力學(xué)過(guò)程。

另外，填料多位點(diǎn)吸附也會(huì)增加非特異性吸附的可能。如果在工藝上使用了較長(zhǎng)的保留時(shí)間，蛋白分子表面可能會(huì)與某些填料形成多個(gè)位點(diǎn)的吸附。一旦蛋白質(zhì)被填料上的多個(gè)吸附位點(diǎn)結(jié)合，那蛋白質(zhì)的解離速率常數(shù)將會(huì)大幅下降。目標(biāo)蛋白質(zhì)在純化層析圖譜上表現(xiàn)為洗脫峰嚴(yán)重拖尾，或者根本無(wú)法被正常洗脫，導(dǎo)致洗脫體積增加或者收率下降（Lenhoff, 2011）；而非目的蛋白質(zhì)的非特異性吸附增強(qiáng)，則會(huì)導(dǎo)致填料清洗困難，填料使用壽命縮短。

• 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性需要合適的溶液條件，而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處的溶液體系逼近穩(wěn)定邊界時(shí)，蛋白質(zhì)的局部結(jié)構(gòu)會(huì)變得松弛，暴露出內(nèi)部疏水區(qū)域，在純化時(shí)會(huì)顯著增強(qiáng)非特異性吸附（Hallgren et al., 2000; Lenhoff, 2011）。

• 瓊脂糖基質(zhì)填料因具有天然多糖結(jié)構(gòu)，其表面具備高度親水性，使得基質(zhì)本身對(duì)蛋白質(zhì)分子的吸附能力極弱；同時(shí)，它在較寬的pH值和離子強(qiáng)度范圍內(nèi)，仍能穩(wěn)定保持極低的非特異性吸附性能。正是這些特性，讓瓊脂糖基質(zhì)通常表現(xiàn)出極低的非特異性吸附，也使其成為蛋白質(zhì)純化（尤其是單克隆抗體等大分子純化）中最常用的基質(zhì)之一。

• 而聚合物基質(zhì)的填料，為了增加填料表面的親水性，常常會(huì)在其表面做一些親水性的修飾，而這些親水修飾并非絕對(duì)安全。首先，親水修飾可能不完全，導(dǎo)致填料上會(huì)殘余一些官能團(tuán)，這可能引起非特異性吸附；其次，表面親水修飾看似解決了非特異性型吸附，卻有可能使得填料局部的配基密度過(guò)高，從而造成非特異性吸附的增強(qiáng)。另外，部分聚合物基質(zhì)孔徑較小，蛋白質(zhì)在填料孔內(nèi)的傳質(zhì)受到空間位阻的影響，孔內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度遠(yuǎn)高于樣品中的濃度，蛋白質(zhì)相當(dāng)于被富集，這又會(huì)放大非特異性吸附作用（Müller, 1990; Lenhoff, 2011）。

• 在緩沖液中加入合適的添加劑，如精氨酸、脯氨酸或0.1~0.5%非離子表面活性劑，提高蛋白質(zhì)非特異性吸附發(fā)生的熱力學(xué)閾值，防止非特異性吸附的發(fā)生。

• 在離子交換層析中，使用更高強(qiáng)度的緩沖液（如50mM代替20mM），防止填料表面處的pH波動(dòng)誘導(dǎo)蛋白分子構(gòu)象改變。

• 分步洗脫策略：如果是非目標(biāo)蛋白的非特異性吸附，我們可以利用非特性型吸附組分與目標(biāo)蛋白在解吸附動(dòng)力學(xué)上的差異，通過(guò)調(diào)節(jié)pH和或鹽梯度控制，進(jìn)行分步洗脫提高純度。

• 優(yōu)化保留時(shí)間：在保證收率的前提下盡量縮短保留時(shí)間，防止非特異性結(jié)合變強(qiáng)。

[2] Haynes, C.A. & Norde, W. (1994). Globular proteins at solid/liquid interfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2, 517-566. 

[3] Hallgren, E. et al. (2000). Protein retention in ion-exchange chromatography: effect of net charge and charge distribution. Journal of Chromatography A, 877(1-2), 13-24. 

[4] Lenhoff, A.M. (2011). Protein adsorption and transport in polymer-functionalized ion-exchangers. Journal of Chromatography A, 1218(49), 8748-8759. 

[5] Müller, W. (1990). New ion exchangers for the chromatography of biopolymers. Journal of Chromatography A, 510, 133-140.