近十年，腫瘤微環(huán)境作為腫瘤研究領(lǐng)域的分支之一，在很多方面取得了進展，其重要原因在于腫瘤樣本組織具有與生物復雜性相關(guān)的顯著空間異質(zhì)性。而腫瘤微環(huán)境研究可以揭示其中奧秘。

多重免疫熒光染色作為腫瘤微環(huán)境研究的重要手段之一，可以同時顯示多種生物標志物，實現(xiàn)識別細胞類型，以及研究信號通路和繪制腫瘤微環(huán)境中復雜的細胞互作圖譜。

盡管近年出現(xiàn)幾種新技術(shù)，但在生物標志物發(fā)現(xiàn)和診斷領(lǐng)域工作的研究人員和臨床醫(yī)生仍然面臨技術(shù)瓶頸：
1）組織微陣列技術(shù)的使用受到腫瘤異質(zhì)性限制，
2）新型多維度空間生物學技術(shù)成本高昂。

在此背景下，Innopsys公司開發(fā)了 InnoQuant激光共聚焦熒光掃描儀，其具有經(jīng)過優(yōu)化的獨特光學設計，可提供高質(zhì)量免疫熒光染色圖片，有助于高內(nèi)涵數(shù)據(jù)的生成和分析。

實際案例：
NSCLC多重組織成像的案例研究
實驗目的：研究非小細胞肺癌(NSCLC)中癌癥組織中的免疫浸潤
非小細胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌的85%。目前，使用靶向腫瘤特定分子特征的治療藥物已成為標準方案。因此，研究腫瘤組織樣本，以此來表征免疫細胞和免疫檢查點有助于個體化的靶向治療。

實驗方法：
1. 利用多重免疫組織化學(mIHC)在單一組織切片上同時染色多種免疫標志物
1) PD-L1是一種免疫檢查點標志物，在髓系細胞和腫瘤細胞中表達，并作為癌癥免疫治療的潛在靶點，本實驗中作為腫瘤細胞標志物。
2) 顆粒酶B (Granzyme B，GrB)是一種絲氨酸蛋白酶顆粒酶，主要存在于自然殺傷細胞(NK細胞)和細胞毒性T細胞的顆粒中，本實驗中作為NK細胞標志物。
3) CD8存在于T細胞中，本實驗中作為細胞毒性T細胞標志物。
4) 使用Cell Signaling 公司mIHC熒光抗體進行非小細胞肺癌樣本染色，具體如下: FITC標記PD-L1，AF594標記CD8，Cy5標記GrB。

2. 利用InnoQuant激光共聚焦熒光掃描儀掃描組織切片
1) 利用GrB標記物鑒定NK細胞：采用640nm激發(fā)波長產(chǎn)生Cy5信號，通過680/42 BP濾波器采集其發(fā)射信號。
2) 利用CD8標記物鑒定T細胞：采用561nm激發(fā)波長產(chǎn)生AF594信號，通過593/40 BP濾波器采集其發(fā)射信號。

3. QuPath軟件分析
利用QuPath的深度學習功能，分別識別NK細胞和CD8+ T細胞。采用Delauney聚類特征2D法鑒定NK細胞簇和CD8+ T細胞簇。分析3個相鄰NK或CD8+ T細胞所包圍的三角形面積與 腫瘤區(qū)域邊界到NK或CD8+ T細胞中心距離之間的關(guān)系。
 
實驗結(jié)果:
1. 樣本掃描總體情況：
冷凍切片厚度:5µm。冷凍切片總面積:97 mm²。4個熒光通道掃描時間:10分鐘。ROI面積:2 mm²（圖1）。  
2．自然殺傷(NK)細胞簇分析
圖2中黃色標記區(qū)域為腫瘤細胞區(qū)域，藍色標記NK細胞分布在腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)部和外部。圖中大部分NK細胞集中在腫瘤細胞區(qū)域周圍，部分NK細胞在腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)。 三個NK細胞間面積（µm²）被定義為由三個相鄰NK細胞圍成的三角形面積。最近腫瘤區(qū)域邊界距離（µm）表示NK細胞質(zhì)心到最近腫瘤細胞區(qū)域邊界的距離。如距離為正，則NK細胞位于腫瘤細胞區(qū)域外部，如距離為負，則NK細胞位于腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)部。
 
對距腫瘤細胞區(qū)域不同距離的相鄰三個NK細胞間面積的分析表明，絕大部分相鄰NK細胞形成的三角形面積都在600μm2以下，且與腫瘤細胞區(qū)域邊界的距離都在±12μm的范圍內(nèi)。面積越小，證明NK細胞密度越高，而且都集中分布在腫瘤區(qū)域周圍。正如圖2中所看到的，NK細胞的分布受到腫瘤細胞區(qū)域的影響，絕大部分NK細胞都圍繞著腫瘤細胞區(qū)域（圖3）。  
3．CD8+ T細胞簇分析
圖4中黃色標記區(qū)域為腫瘤細胞區(qū)域，品紅色標記CD8+ T細胞分布在腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)部和外部。圖中大部分CD8+ T細胞集中在腫瘤細胞區(qū)域周圍，部分CD8+ T細胞在腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)。  
三個CD8+ T細胞間面積（µm²）被定義為由相鄰三個CD8+ T細胞圍成的三角形面積。最近腫瘤區(qū)域邊界距離（µm）表示CD8+ T細胞質(zhì)心到最近腫瘤細胞區(qū)域邊界的距離。如距離為正，則CD8+ T細胞位于腫瘤細胞區(qū)域外部。如距離為負，則CD8+ T細胞位于腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)部。
 
對距腫瘤細胞區(qū)域不同距離的相鄰三個 CD8+ T 細胞間面積的分析表明，絕大部分相鄰CD8+ T細胞形成的三角形面積都在600μm2以下，且與腫瘤細胞區(qū)域邊界的距離都在±12μm的范圍內(nèi)。面積越小，證明CD8+ T細胞密度越高，而且都集中分布在腫瘤區(qū)域周圍。說明正如圖4中所看到的，CD8+ T細胞的分布受到腫瘤細胞區(qū)域的影響，絕大部分CD8+ T細胞都圍繞著腫瘤細胞區(qū)域（圖5）。  
實驗結(jié)論：
無論是NK細胞還是CD8+ T細胞，都受到腫瘤區(qū)域的影響，集中分布在腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)外，不斷浸潤腫瘤組織。

利用全組織掃描成像并結(jié)合深度學習算法，可以識別不同免疫細胞以及分析其與腫瘤區(qū)域的距離。本案例證明了InnoQuant提供的整張掃描圖像可以在第三方分析軟件中生成相關(guān)數(shù)據(jù)。圖像質(zhì)量高，可以得到如細胞計數(shù)和鄰近分析等統(tǒng)計學分析，以更好地了解患者的特定病理生理狀況。這些空間和定量的數(shù)據(jù)可用于進一步預測免疫腫瘤領(lǐng)域的治療反應。
 
Innopsys 成立于1999年�？偛课挥诜▏�，致力于生物醫(yī)學領(lǐng)域相關(guān)儀器和軟件的自主研發(fā)和生產(chǎn)。
InnoQuant激光共聚焦熒光組織切片&生物芯片掃描儀：
 
* 實時激光共聚焦光路，4套獨立的激光光源和PMT檢測器，成像質(zhì)量高；
* 多激光光路同時掃描，掃描速度快；
* 線掃描方式，圖片無拼痕、無需陰影矯正，并有效降低熒光的光漂白現(xiàn)象及信號損失，實現(xiàn)精準定量；
* 組織切片的掃描和定量分析，用于神經(jīng)生物學、腫瘤微環(huán)境、單細胞蛋白組學等領(lǐng)域；
* 微陣列芯片（基因／核酸／糖／蛋白／化合物芯片）、 單細胞WB免疫印跡芯片、覆膜芯片、細胞組織芯片及商品化芯片的掃描和分析，用于蛋白互作分析、細胞信號轉(zhuǎn)導通路研究、疾病標志物篩選、化合物藥物篩選、多重因子檢測，病理組織標志物篩查等研究 。  
環(huán)亞生物科技（APG BIO）作為法國Innopsys公司中國區(qū)代理，為客戶提供生物芯片掃描、點樣以及高通量篩選的整體解決方案和服務。