分選原理
選用生物素（biotin）標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞（非 CD3+ T 細(xì)胞）進(jìn)行標(biāo)記，然后通過(guò)鏈霉親和素（streptavidin）標(biāo)記的磁珠對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行清除，從而達(dá)到人外周血 CD3+ T 細(xì)胞分選的目的。分選過(guò)程需要用到磁力架。

分選試劑及儀器
人CD3+T細(xì)胞分選試劑盒（陰選法）(abs50126)

產(chǎn)品組成：

細(xì)胞磁性分離器（多功能）(abs90335）

分選方法
1、制備人 PBMC：利用 Ficoll 密度梯度離心法從人外周血中分離 PBMC，收集 PBMC，以 PBS
洗滌細(xì)胞，離心后將 PBMC重懸于分選 buffer中，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×10⁸ cells/mL。

2、將 100 μL 細(xì)胞懸液（1×10⁷個(gè)細(xì)胞）加入無(wú)菌流式管底部，再加入 2 μL Biotin-Antibody Mix，混勻后4°C 孵育 10 min。
注意：將細(xì)胞懸液直接加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根據(jù)所使用磁力架不同也可使用離心管進(jìn)行細(xì)胞分選。如果分選更多細(xì)胞，則按比例增加 Biotin-Antibody Mix 的用量。

3、孵育完成后，在流式管中加入 20 μL 清洗過(guò)的 Streptavidin，混勻后 4°C 孵育 10 min（磁珠使用前需要用分選 buffer 進(jìn)行清洗：渦旋振蕩徹底重懸磁珠，取實(shí)驗(yàn)需要的磁珠至 1.5 mL 離心管，加入分選 buffer 至總體積為 1 mL，10000 g，離心 1 min，棄上清。加入 1 mL 分選 buffer 重懸磁珠，10000 g，離心 1 min，棄上清。用與起初相同體積的分選 buffer 重懸磁珠。如取 20 μL 磁珠進(jìn)行清洗，則清洗后用 20 μL 分選 buffer 進(jìn)行重懸）。
注意：如果分選更多細(xì)胞，則按比例增加 Streptavidin 用量。例如分選 5×10⁷ 個(gè)細(xì)胞，在 500 μL 細(xì)胞懸液中加入 10 μL Biotin-Antibody Mix 和 100 μL treptavidin。如果分選少于 1×10⁷個(gè)細(xì)胞，則將細(xì)胞懸液體積補(bǔ)至 100 μL，加入 2 μL Biotin-Antibody Mix 和 20 μL Streptavidin。

4、孵育完成后，在流式管中加入 2.5 mL 分選 buffer，用移液器吹打 5 次混勻（避免劇烈振蕩或者上下顛倒混勻）。

5、將含有細(xì)胞的流式管置于磁力架上，靜置 5 min。

6、將細(xì)胞懸液輕柔倒入一個(gè)無(wú)菌離心管中（傾倒過(guò)程中流式管不要脫離磁力架），此細(xì)胞懸液中即包含純化的人 CD3+ T 細(xì)胞。300 g，離心 5 min。棄上清，收集細(xì)胞。

7、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要洗滌細(xì)胞后，將細(xì)胞重懸于所需緩沖液或培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)。

從人PBMC中分選CD3+ T細(xì)胞，用PE標(biāo)記的 anti-human CD3抗體（克隆號(hào)OKT3）染色后進(jìn)行流式細(xì)胞分析. 結(jié)論：分選前后的CD3+ T細(xì)胞純度分別為69.1%和97.9%。

培養(yǎng)原理
人 CD3/CD28 T 細(xì)胞激活磁珠可以簡(jiǎn)單快捷的活化及擴(kuò)增T 細(xì)胞，無(wú)需飼養(yǎng)層細(xì)胞（抗原遞呈細(xì)胞）或抗原。磁珠為直徑 5 µm 的惰性超順磁珠，大小與抗原呈遞細(xì)胞相似，同時(shí)共價(jià)偶聯(lián)抗CD3 和抗CD28 抗體。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可使用重組人 IL-2 刺激 T 細(xì)胞群擴(kuò)增。活化或擴(kuò)增后，磁珠可以通過(guò)磁力架輕松去除。

培養(yǎng)步驟
一、試劑配置
1、清洗 buffer：含有 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 或者含有 2 mM EDTA 和 5% BSA的 PBS，需預(yù)先通過(guò) 0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌。
2、免疫細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(abs9772)；
3、IL-2(abs04045)；
4、CD3/CD28磁珠(abs160032)；
5、青霉素-鏈霉素溶液(100×,雙抗)（abs9244）

二、操作步驟
1、清洗磁珠
（1）徹底重懸試管中的磁珠（如渦旋>30秒，或置于旋轉(zhuǎn)儀5分鐘）。
（2） 吸取目標(biāo)體積的磁珠至流式管中，加入同等體積的清洗Buffer。若不足1mL，添加1mL的清洗Buffer，渦旋5秒，或使用移液器吹打混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡（此處也可直接使用細(xì)胞培養(yǎng)基清洗）。
（3）將流式管置于磁力架上3分鐘，棄上清。
（4）重復(fù)步驟2-3，本次使用細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)磁珠再次清洗。共清洗磁珠兩次。
（5） 使用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸磁珠（比如：吸取 25 μL 磁珠進(jìn)行清洗，清洗后用 1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行重懸）。

注意事項(xiàng)
取用激活磁珠前徹底重懸磁珠（如渦旋>30秒，或置于旋轉(zhuǎn)儀5分鐘），吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。進(jìn)行流式檢測(cè)前，使用磁力架去除磁珠（包括結(jié)合在細(xì)胞上的磁珠，可以通過(guò)輕柔吹打釋放磁珠），此時(shí)細(xì)胞位于上清液中。收集上清液，進(jìn)行下一步的流式檢測(cè)。

2、人 T 細(xì)胞的擴(kuò)增
（1）調(diào)整CD3+ T細(xì)胞種板濃度為1-1.5 x 10⁶ cells/mL，按照磁珠與細(xì)胞比例1：1加入激活磁珠。
（2）激活 2天后，向培養(yǎng)基中添加 300 U/mL 的重組人 IL-2。
（3）細(xì)胞與磁珠放于 37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中孵育，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)。
  (4)  每日查看細(xì)胞激活與擴(kuò)增情況，注意細(xì)胞的大小和形狀。當(dāng)細(xì)胞皺縮或增殖速度明顯放慢時(shí)，提示細(xì)胞可能耗竭。
（5）推薦在細(xì)胞激活的前 2天時(shí)不要處理細(xì)胞，2 天后隨時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)培養(yǎng)基變黃或孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)目過(guò)多時(shí)換液或傳代。每次換液或傳代后，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充重組人 IL-2 至 300 U/mL。
（6）定期進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，當(dāng)細(xì)胞密度超過(guò) 5x 10⁶ cells/mL 時(shí)，輕柔吹打混勻，將細(xì)胞密度調(diào)整為 0.5-1 x 10⁶ cells/mL。

剛接種的 T 細(xì)胞（棕色為抗體歐聯(lián)磁珠）	T 細(xì)胞-day5-細(xì)胞增殖明顯（T細(xì)胞團(tuán)）

活化人T細(xì)胞的PD-1表達(dá)。人T細(xì)胞用抗人CD3/CD28磁珠刺激，并擴(kuò)增14天


使用人CD3/CD28 T細(xì)胞激活磁珠，刺激CD3+ T細(xì)胞24到48小時(shí)，細(xì)胞用FITC anti-human CD69抗體（克隆號(hào)FN50 ）和PE anti-human CD25抗體（克隆號(hào)BC96）標(biāo)記，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。 結(jié)論：刺激前后CD25+ CD69+ T細(xì)胞占總細(xì)胞的比例分別為0.70% 和75.81%

產(chǎn)品推薦