Section.01
石蠟切片 VS 冰凍切片
有何區(qū)別？

組織樣本的免疫熒光主要有兩種制備方式：石蠟切片和冰凍切片。兩者各有優(yōu)劣，適用場景也大不相同。

石蠟切片免疫熒光 (Paraffin section) 雖在組織形態(tài)保存和長期儲存方面具有優(yōu)勢，但其制備過程涉及高溫烘烤、二甲苯脫蠟等步驟^[1][2]，容易導(dǎo)致某些敏感蛋白 (如細胞表面受體、細胞因子、磷酸化蛋白等) 的抗原表位被破壞或掩蔽，使得抗體“認不出”目標蛋白，造成假陰性。此外，石蠟切片的制備周期較長，不適用于醫(yī)學病理檢測等場景。

相比之下，冰凍切片免疫熒光 (Frozen section immunofluorescence) 直接將新鮮或快速冷凍的組織置于低溫環(huán)境下進行切片。這一過程極大地縮短了制片時間，同時保留了組織中的多種抗原免疫活性。免疫熒光技術(shù)則進一步利用熒光標記的抗體與組織中的特定抗原結(jié)合，通過熒光顯微鏡觀察，實現(xiàn)對抗原的精確定位和可視化^[3]。   

圖 1. 石蠟切片 (上) 和冰凍切片 (下) 流程^[2][4]。

表 1. 石蠟切片、冰凍切片的區(qū)別^[5]。

Section.02
為什么有些蛋白
“非冰凍不可”？

首先，當檢測敏感蛋白/低表達抗原時，石蠟切片的高溫、二甲苯脫蠟等步驟，會導(dǎo)致敏感蛋白抗原表位變性，讓抗體無法識別。冰凍切片低溫冷凍、不接觸高溫和有機溶劑，能保留抗原免疫活性，對細胞表面受體、磷酸化蛋白等敏感抗原的檢測靈敏度遠高于石蠟切片。此外，珍貴、難重復(fù)取材的組織樣本也適合冰凍切片。

其次，在應(yīng)急診斷/手術(shù)中快速診斷時，石蠟切片制備需 2-3 天，無法滿足應(yīng)急需求。冰凍切片 30 分鐘內(nèi)可完成包埋切片，1-2 小時完成染色，是手術(shù)切緣判斷、急性病變診斷的首選，能為臨床決策及時提供依據(jù)^[1]。

此外，在進行多抗原共定位分析時——石蠟切片：不同抗原修復(fù)條件不一，易出現(xiàn)修復(fù)不均問題；冰凍切片：無需抗原修復(fù)，可同時孵育多種一抗，實現(xiàn)多通道熒光標記，清晰呈現(xiàn)多種抗原的空間分布關(guān)系。

Section.03
冰凍切片免疫熒光
怎么做？

圖 2. OCT 包埋、冷凍切片以及顯微鏡下觀察示意圖^[6]。

冰凍切片免疫熒光詳細步驟^[4][5]：

組織前處理

『取材與固定』

快速取出新鮮組織 (如小鼠腦、肝、腎等)，用 1xPBS 沖洗去除血跡，浸沒在 4% PFA，放在 4℃ 固定 12-24 小時。

『脫水』

隨后將固定后的組織轉(zhuǎn)移至 15% 蔗糖溶液 (4℃)，待其完全沉底 (約數(shù)小時)；轉(zhuǎn)入 30% 蔗糖溶液 (4℃) ，繼續(xù)孵育直至再次完全沉底 (一般過夜)，目的是為了脫去水分；

『包埋與冷凍』

取出沉底的組織，用濾紙輕輕吸干表面多余水分。放入包埋模具中，用足量的 OCT 包埋劑完全覆蓋組織，確保沒有氣泡。接著迅速放在干冰或液氮氣相層進行速凍，直至形成白色硬塊，取出后可立即放入 -80℃ 冰箱保存，或直接用于切片。

 注意：
(1) 固定時間不宜過長，防止過度交聯(lián)影響抗原暴露。
(2) 蔗糖溶液要用 PBS 配制，不推薦用水溶解。
(3) 若組織未完全沉底即進行冷凍，易因水分過多而產(chǎn)生冰晶空洞。
(4) 冷凍速度越快，形成的冰晶越小，組織結(jié)構(gòu)保存越好。

切片與免疫染色

『切片』

提前將 OCT 包埋塊放入冷凍切片機腔體 (溫度 -20℃ 左右)，平衡 30 分鐘。

修整組織表面，設(shè)置切片厚度 (一般 5-10 μm)。轉(zhuǎn)動切片機輪盤，輔以防卷板，連續(xù)平整切片并貼附在防脫載玻片上，置于室溫晾干 30-60 分鐘后儲存于 -80℃ 或者直接進行下一步。

『封閉和穿孔』

將切片用 1xPBS 清洗 3 次，每次 5 min，目的是為了去除切片表面的 OTC，再甩去多余液體，在組織周圍用疏水筆畫圈，并向組織加入封閉液 (5% 正常山羊血清或 5% BSA+ 0.3% Triton X-100)，室溫孵育 1 h。

『一抗孵育』

吸去封閉液，立即在組織部分滴加合適比例的一抗，確保整個組織都覆蓋。將載玻片放回濕潤的盒子里，4℃ 冰箱過夜。接著取出后先放復(fù)溫至室溫，用 1xPBS 清洗 3 次，每次 5 min。

『二抗孵育』

再滴加熒光標記的二抗，室溫避光孵育 1 h。用 1xPBS 清洗 3 次，每次 5 min。

『染核與封片』

盡量吸干玻片上殘余的水分，在樣品處滴加含有 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片進行封片，盡量排除氣泡。室溫通風晾干 2-4 小時，或 4℃ 避光保存過夜。

『觀察和圖像處理 』

使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察并拍照。圖片可用 ImageJ 軟件進行分析處理。

 注意：
1) 操作過程中應(yīng)避免組織長時間處于干燥狀態(tài)；
2) 熒光染色過程需要避光。

Section.04
常見問題+
解決方案

Q1. 背景普遍較高，非特異性信號多

可能原因：封閉不充分；熒光二抗非特異性結(jié)合；組織樣品干燥時間長

解決方案：延長封閉時間；二抗種屬來源一致或使用；操作過程保持組織樣品濕潤。

Q2. 顯微鏡下視野中“黑洞”較多

可能原因：蔗糖脫水不徹底；冷凍速度太慢形成冰晶；封片時未排盡氣泡

解決方案：確保 30% 蔗糖完全沉底；包埋時用液氮/干冰速凍；封片確保氣泡全部去除。

Q3. 組織容易脫落載玻片

可能原因：載玻片材料不合適；切片未在室溫下復(fù)溫就染色。

解決方案：選用Superfrost Plus 防脫載玻片；室溫下復(fù)溫 30 min 左右。

其實！石蠟切片和冰凍切片，從來不是“對立關(guān)系”，而是“互補關(guān)系”——

(1) 如需做常規(guī)病理、長期存檔、不敏感抗原檢測，選石蠟切片，省心又穩(wěn)定；

(2) 如需做敏感抗原、低表達抗原、術(shù)中快速診斷，選冰凍切片，精準又高效。

冰凍切片免疫熒光的核心優(yōu)勢是“保留抗原活性”，這是石蠟切片無論如何優(yōu)化都難以替代的。雖說冰凍切片步驟略多，但只要掌握正確方法，避開常見坑，就可獲得實驗順利！

產(chǎn)品推薦
 

Tissue and Cell Fixative (4% Paraformaldehyde, PFA) (HY-DY3003)  組織細胞固定液 (4% PFA)

Sucrose (HY-B1779) 蔗糖

AntiFade Mounting Medium (with DAPI) (HY-K1047) 抗熒光淬滅封片劑 (含 DAPI)

Polyethylene glycol mono(4-tert-octylphenyl) ether (HY-Y1883A) 聚乙二醇單辛基苯基醚 X-100

參考文獻

[1] Qin C, et al. The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning. J Vis Exp. 2018 Sep 5;(139):58288.
[2] Zaquot et al. (2020). Immunofluorescence Staining of Paraffin Sections Step by Step.
[3] Punchihewa et al. (2021). Immunostained Frozen Sections Vs Traditional Permanent Paraffin Sections for Lentigo Maligna.
[4] Davis et al. Preparation of Frozen Sections.
[5] Spencer L T. Microtomy for paraffin and frozen sections[J]. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques, 8th ed.; Suvarna, SK, Layton, C., Bancroft, JD, Eds, 2018: 84-95.
[6] Ma X, et al. Protocol for Xenium spatial transcriptomics studies using fixed frozen mouse brain sections. STAR Protoc. 2024 Dec 20;5(4):103420.