Section.01
Nature 子刊: IsoNet 策略

目前仍有超過(guò) 30% 的人類基因功能未被明確注釋，其中相當(dāng)一部分被推測(cè)編碼代謝相關(guān)酶類。雖然基于體外酶活性的代謝組學(xué)篩選技術(shù)可用于發(fā)現(xiàn)未知反應(yīng)，但其回收率普遍較低 (通常低于 20%) ，難以實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)性覆蓋，且多數(shù)反應(yīng)無(wú)法在生理環(huán)境下得到驗(yàn)證。這些“缺失”的反應(yīng)構(gòu)成了代謝網(wǎng)絡(luò)中的“暗物質(zhì)”，嚴(yán)重制約了我們對(duì)細(xì)胞生理及疾病機(jī)制的系統(tǒng)性認(rèn)知^[1]。

值得關(guān)注的是，研究開發(fā)的 IsoNet (Isotopologue Similarity Networking) 策略，通過(guò)整合穩(wěn)定同位素示蹤代謝組學(xué)與同位素異構(gòu)體模式相似性網(wǎng)絡(luò)分析，可在無(wú)先驗(yàn)假設(shè)的前提下，直接從活細(xì)胞及動(dòng)物體內(nèi)推斷并驗(yàn)證未知代謝反應(yīng)。該方法無(wú)需酶純化，有效規(guī)避了體外篩選的低回收率瓶頸，顯著拓展了可檢測(cè)反應(yīng)的類型與范圍——包括非酶促反應(yīng)。通過(guò)系統(tǒng)構(gòu)建同位素相似性網(wǎng)絡(luò)，IsoNet 實(shí)現(xiàn)了代謝反應(yīng)的高通量發(fā)現(xiàn)與功能解析，為繪制完整代謝圖譜、揭示代謝通路在生理與病理過(guò)程中的作用提供了強(qiáng)大的無(wú)偏倚工具。

在代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中，反應(yīng)步驟超過(guò) 7 步的代謝物對(duì)被定義為非反應(yīng)對(duì)。原始數(shù)據(jù)以源數(shù)據(jù)文件的形式提供（圖 1）。

圖 1.在穩(wěn)定同位素示蹤代謝組學(xué)中，反應(yīng)相關(guān)的代謝物往往具有相似的同位素異構(gòu)體模式。

A. 代謝反應(yīng)相關(guān)代謝物生成示意圖及其同位素異構(gòu)體模式相似性計(jì)算。B. 在用全碳13 標(biāo)記谷氨酰胺或 全碳13 標(biāo)記葡萄糖標(biāo)記 17 小時(shí)的 293T 細(xì)胞中檢測(cè)到的標(biāo)記代謝物和反應(yīng)對(duì)的數(shù)量。C. 在用全碳13標(biāo)記谷氨酰胺標(biāo)記的 293T 細(xì)胞中，反應(yīng)相關(guān)代謝物 (天冬酰胺/天冬氨酸和天冬氨酸/乳清酸) 的同位素異構(gòu)體模式相似性評(píng)分 (S_ISO) (每組 n = 6 個(gè)生物學(xué)重復(fù))。數(shù)值表示平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤。D. 在用全碳13標(biāo)記葡萄糖標(biāo)記的 293T 細(xì)胞中，反應(yīng)相關(guān)代謝物 (谷氨酸/α-酮戊二酸和 α-酮戊二酸/順式烏頭酸)的同位素異構(gòu)體模式相似性評(píng)分 (S_ISO) (每組 n = 6 個(gè)生物學(xué)重復(fù))。數(shù)值表示平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤。E. 在用全碳13標(biāo)記谷氨酰胺或全碳13標(biāo)記葡萄糖標(biāo)記的 293T 細(xì)胞中，反應(yīng)對(duì) (RP) 和非反應(yīng)對(duì) (non-RP) 中兩種代謝物具有高同位素異構(gòu)體相似性評(píng)分 (S_ISO ≥ 0.7) 的百分比。

Section.02
核心成果:
從"已知地圖"走向"未知大陸"

該研究的主要成果可以概括為三點(diǎn)：

『1. 提出 IsoNet 方法學(xué)框架』

研究發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定同位素示蹤實(shí)驗(yàn)中，具有直接生化轉(zhuǎn)化關(guān)系的底物與產(chǎn)物，其同位素異構(gòu)體分布模式 (isotopologue patterns) 高度相似�；�于此，團(tuán)隊(duì)開發(fā)了同位素模式相似性評(píng)分 (S_ISO score)，并以此構(gòu)建代謝物間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，從而在全代謝組層面無(wú)偏倚地推斷潛在代謝反應(yīng)。

『2. 系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)數(shù)百個(gè)潛在新代謝反應(yīng)』

在 HEK293T 細(xì)胞、小鼠肝臟及誘導(dǎo)性骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞 (iBMDM) 中，IsoNet 共推斷出數(shù)百對(duì)具有高置信度的代謝物轉(zhuǎn)化關(guān)系，涵蓋氧化還原、基團(tuán)轉(zhuǎn)移、水解、連接等多種反應(yīng)類型。其中大量反應(yīng)未被收錄于 KEGG、HMDB 或 MetaCyc 等主流代謝數(shù)據(jù)庫(kù)。

『3. 重構(gòu)谷胱甘肽代謝子網(wǎng)絡(luò)』

研究聚焦于谷胱甘肽 (GSH) 相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn) GSH 可通過(guò)一種新型轉(zhuǎn)硫反應(yīng) (transsulfuration)，將其半胱氨酸殘基替換為絲氨酸，直接生成新代謝物 γ-谷氨酰-絲氨酰-甘氨酸 (γ-Glu-Ser-Gly)。該結(jié)果表明，谷胱甘肽不僅是經(jīng)典抗氧化劑，還可作為內(nèi)源性硫供體參與代謝調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)認(rèn)為 γ-谷氨酰三肽僅通過(guò) ATP 依賴的連接酶合成的認(rèn)知。

Section.03
穩(wěn)定同位素標(biāo)記物:
研究的"發(fā)動(dòng)機(jī)"

IsoNet 能夠成立的前提，是高質(zhì)量的穩(wěn)定同位素示蹤數(shù)據(jù)。該研究系統(tǒng)使用了多種碳 13 標(biāo)記化合物，它們均為全碳 13 標(biāo)記的化合物如：全碳 13 標(biāo)記葡萄糖 (D-Glucose-¹³C₆)、全碳 13 標(biāo)記谷氨酰胺 (L-Glutamine-¹³C₅)、全碳 13 標(biāo)記乙酸 (Acetic acid-¹³C₂) 、全碳 13 標(biāo)記絲氨酸 (L-Serine-¹³C₃)、全碳 13 標(biāo)記半胱氨酸 (L-Cysteine-¹³C₃)、全碳 13 標(biāo)記甘氨酸 (Glycine-¹³C₂)、全碳 13 標(biāo)記的丙酮酸鈉 (Pyruvic acid-¹³C₃ sodium) 等。

這些全碳 13 標(biāo)記化合物，覆蓋了糖酵解、TCA 循環(huán)、氨基酸代謝和谷胱甘肽合成等關(guān)鍵代謝通路，使研究者能夠根據(jù)碳 13 標(biāo)記原子追蹤其在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的去向。

與傳統(tǒng)同位素實(shí)驗(yàn)只驗(yàn)證單條假設(shè)通路不同，本研究關(guān)注的是所有代謝物的同位素分布形態(tài)。只要兩個(gè)代謝物在細(xì)胞中存在直接反應(yīng)關(guān)系，它們的同位素“指紋”就會(huì)呈現(xiàn)高度相似性，這正是 IsoNet 的邏輯基礎(chǔ)。這也是 IsoNet 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做分析的重要依據(jù)。

Section.04
同位素標(biāo)記：實(shí)驗(yàn)流程

從研究者設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)操作來(lái)看，該研究為穩(wěn)定同位素示蹤提供了一個(gè)可復(fù)制、可擴(kuò)展的范式，也為后續(xù)的研究提供了較好的指導(dǎo)范例，以下為以細(xì)胞為例作者做實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)流程：

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與標(biāo)記條件

細(xì)胞系：293T 細(xì)胞、iBMDM (永生化骨髓源性巨噬細(xì)胞) 等。培養(yǎng)基：使用含 10% 透析胎牛血清 (dFBS) 和 1% 青霉素-鏈霉素的 DMEM。標(biāo)記時(shí)機(jī)：細(xì)胞生長(zhǎng)至 80% 匯合度時(shí)更換為含同位素標(biāo)記物的新鮮培養(yǎng)基。標(biāo)記時(shí)間：通常為 17 小時(shí) (可根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整)。

2. 標(biāo)記物濃度

表格 1. 單一/混合標(biāo)記底物使用濃度計(jì)培養(yǎng)基

3. 代謝淬滅與提取

快速移除培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次。置于干冰上，加入預(yù)冷的代謝提取液 (甲醇/水 = 80/20，V/V) 淬滅代謝。 ?80 ℃ 孵育 40 分鐘。刮取細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管，再用 400 μL 提取液清洗培養(yǎng)皿，合并提取液。渦旋 1 分鐘，4 ℃、16200 × g 離心 10 分鐘，取上清。如測(cè)定半胱氨酸等易氧化代謝物，可取部分上清進(jìn)行 N-乙基馬來(lái)酰亞胺 (NEM) 衍生化處理。剩余上清在真空濃縮儀中 4 ℃ 干燥，?80 ℃ 保存。

4. 樣本前處理

干燥樣本用 100 μL 乙腈:水 (1:1，v/v) 復(fù)溶。超聲 10 分鐘，4 ℃、16200 × g 離心 15 分鐘。取上清進(jìn)行 LC-MS 分析。

5. 數(shù)據(jù)預(yù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng) ProteoWizard 轉(zhuǎn)換為 mzXML (MS1) 和 mgf (MS2) 格式。    使用 xcms 進(jìn)行峰檢測(cè)與對(duì)齊。通過(guò) MetDNA 進(jìn)行已知代謝物注釋 (MSI Level 1-2)。未知特征峰經(jīng) CAMERA 去冗余、Genform 預(yù)測(cè)分子式。使用 MetTracer 提取標(biāo)記代謝物的同位素分布。采用 Accucor 進(jìn)行天然同位素校正。

6. IsoNet 分析

A. 同位素相似性網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：計(jì)算代謝物對(duì)的同位素模式相似性得分 (Siso)。結(jié)合 MS/MS 譜圖相似性 (余弦得分)。構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)：節(jié)點(diǎn)為標(biāo)記代謝物，邊表示 Siso > 0.7 且 MS² 相似性 > 0.5。

B. 反應(yīng)推斷與注釋：利用 KEGG 反應(yīng)庫(kù)和 Delta Mass 庫(kù)匹配代謝物對(duì)的質(zhì)量差 (Δm/z)。推斷反應(yīng)類型 (如氧化、轉(zhuǎn)移、水解等) 及原子差異。

7. 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

A. 化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證：合成新發(fā)現(xiàn)代謝物 (如 γ-Glu-Ser-Gly、S-乙酰谷胱甘肽等)。通過(guò)保留時(shí)間、MS/MS 譜圖及核磁共振 (NMR) 比對(duì)確認(rèn)結(jié)構(gòu)。

B. 能與機(jī)制驗(yàn)證：抑制劑處理：使用 BSO (谷胱甘肽合成抑制劑) 驗(yàn)證代謝物與谷胱甘肽代謝通路的關(guān)聯(lián)。基因敲降：通過(guò) siRNA 敲低 GCS (谷氨酰半胱氨酸合成酶)，觀察代謝物水平變化。體外反應(yīng)驗(yàn)證：在無(wú)酶體系中孵育底物 (如谷胱甘肽 + 乙酰輔酶 A)，驗(yàn)證非酶促反應(yīng)。分類為已知反應(yīng)、I 型未知反應(yīng) (已知-未知代謝物對(duì))、II 型未知反應(yīng) (未知-未知代謝物對(duì))。

該實(shí)驗(yàn)流程的優(yōu)勢(shì)在于：無(wú)需提前設(shè)定靶點(diǎn)，真正實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)發(fā)現(xiàn)。

Section.05
小結(jié)

IsoNet 解決的問題：突破“已知代謝物-已知反應(yīng)”的研究邊界；將穩(wěn)定同位素示蹤從假設(shè)驗(yàn)證工具升級(jí)為無(wú)偏倚發(fā)現(xiàn)引擎；系統(tǒng)揭示非經(jīng)典、非酶促或低豐度代謝反應(yīng)。如需更多同位素標(biāo)記物請(qǐng)參考 MCE 官網(wǎng)。

[1] Gao Y, etal. Charting unknown metabolic reactions by mass spectrometry-resolved stable-isotope tracing metabolomics. Nat Commun. 2025 May 31;16 (1):5059