全人源TCS肝細(xì)胞三培養(yǎng)體系在肝毒性評(píng)估中的應(yīng)用
全人源TCS肝細(xì)胞三培養(yǎng)體系與肝毒性評(píng)估
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全人源TCS肝毒評(píng)估核心看點(diǎn)
預(yù)測(cè)藥物及化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的肝毒性仍是一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)。藥物研發(fā)過(guò)程中的基于動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)常無(wú)法識(shí)別此類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)，因其難以模擬非實(shí)質(zhì)細(xì)胞在應(yīng)對(duì)化合物干擾及疾病進(jìn)展中的作用。傳統(tǒng)的體外肝臟模型系統(tǒng)，例如原代人肝細(xì)胞單層培養(yǎng)，缺乏關(guān)鍵功能，或隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和完整性會(huì)喪失。
本研究開(kāi)發(fā)了一種全人源三培養(yǎng)體系（Tri-Culture System,TCS），分為24孔板和96孔板兩種規(guī)格，由原代人肝細(xì)胞（Primary Human Hepatocytes, PHHs）與源自捐贈(zèng)人體組織的內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞組成。我們通過(guò)檢測(cè)關(guān)鍵細(xì)胞間相互作用和連接極性標(biāo)志物的定位、白蛋白和尿素的合成以及CYP酶的基礎(chǔ)活性和誘導(dǎo)活性，在4周內(nèi)評(píng)估了關(guān)鍵自組裝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)和維持情況，從而確定了最合適的細(xì)胞密度和比例。對(duì)來(lái)自多位健康及患病供體的肝細(xì)胞進(jìn)行單培養(yǎng)與三培養(yǎng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：?jiǎn)闻囵B(yǎng)體系中，白蛋白和尿素的基礎(chǔ)合成速率、CYP酶基礎(chǔ)活性及誘導(dǎo)活性均明顯下降（白蛋白和尿素合成量下降超過(guò)50%，因細(xì)胞流失導(dǎo)致CYP基礎(chǔ)表達(dá)水平檢測(cè)不到）；而TCS中，上述細(xì)胞與生化指標(biāo)在培養(yǎng)初期4-7天內(nèi)升高，于7-10天達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平（白蛋白和尿素表達(dá)量維持在20%的范圍內(nèi)，CYP酶誘導(dǎo)倍數(shù)變化超過(guò)10倍）。這些結(jié)果直接與ZO-1和Cx32介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞連接促進(jìn)的肝細(xì)胞重塑以及功能性膽小管的形成相對(duì)應(yīng)。無(wú)論供體背景如何，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存在可在數(shù)周培養(yǎng)期內(nèi)維持并增強(qiáng)肝細(xì)胞的完整性、極性及功能。綜上，該全人源三培養(yǎng)體系為研究藥物對(duì)健康及患病供體肝細(xì)胞功能的有效性與潛在毒性，提供了一種具有前景的新型分析工具。
一、全人源TCS體系：研究背景與目的
這項(xiàng)研究旨在開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證一種全人源肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)可長(zhǎng)期維持肝細(xì)胞的表型結(jié)構(gòu)、肝臟基本功能及代謝能力，適用于病理學(xué)與毒理學(xué)研究。有研究表明，利用小鼠3T3成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)可增強(qiáng)細(xì)胞完整性、對(duì)受體激動(dòng)劑的應(yīng)答能力及代謝功能（1-3）。然而，目前仍需要一種全人源且供體匹配的共培養(yǎng)體系，以模擬肝損傷及疾病進(jìn)展過(guò)程中的細(xì)胞間事件。本研究描述了一種全人源肝細(xì)胞三培養(yǎng)體系（TCS），該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了維持來(lái)自多個(gè)供體（代表不同正常和病變肝組織背景）的人類(lèi)肝細(xì)胞批次的結(jié)構(gòu)完整性和基本功能的初步目標(biāo)。
二、全人源TCS體系：肝細(xì)胞培養(yǎng)與功能檢測(cè)方法
1.肝細(xì)胞培養(yǎng)體系
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全人源TCS肝毒評(píng)估核心看點(diǎn)
預(yù)測(cè)藥物及化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的肝毒性仍是一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)。藥物研發(fā)過(guò)程中的基于動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)常無(wú)法識(shí)別此類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)，因其難以模擬非實(shí)質(zhì)細(xì)胞在應(yīng)對(duì)化合物干擾及疾病進(jìn)展中的作用。傳統(tǒng)的體外肝臟模型系統(tǒng)，例如原代人肝細(xì)胞單層培養(yǎng)，缺乏關(guān)鍵功能，或隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和完整性會(huì)喪失。
本研究開(kāi)發(fā)了一種全人源三培養(yǎng)體系（Tri-Culture System,TCS），分為24孔板和96孔板兩種規(guī)格，由原代人肝細(xì)胞（Primary Human Hepatocytes, PHHs）與源自捐贈(zèng)人體組織的內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞組成。我們通過(guò)檢測(cè)關(guān)鍵細(xì)胞間相互作用和連接極性標(biāo)志物的定位、白蛋白和尿素的合成以及CYP酶的基礎(chǔ)活性和誘導(dǎo)活性，在4周內(nèi)評(píng)估了關(guān)鍵自組裝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)和維持情況，從而確定了最合適的細(xì)胞密度和比例。對(duì)來(lái)自多位健康及患病供體的肝細(xì)胞進(jìn)行單培養(yǎng)與三培養(yǎng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：?jiǎn)闻囵B(yǎng)體系中，白蛋白和尿素的基礎(chǔ)合成速率、CYP酶基礎(chǔ)活性及誘導(dǎo)活性均明顯下降（白蛋白和尿素合成量下降超過(guò)50%，因細(xì)胞流失導(dǎo)致CYP基礎(chǔ)表達(dá)水平檢測(cè)不到）；而TCS中，上述細(xì)胞與生化指標(biāo)在培養(yǎng)初期4-7天內(nèi)升高，于7-10天達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平（白蛋白和尿素表達(dá)量維持在20%的范圍內(nèi)，CYP酶誘導(dǎo)倍數(shù)變化超過(guò)10倍）。這些結(jié)果直接與ZO-1和Cx32介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞連接促進(jìn)的肝細(xì)胞重塑以及功能性膽小管的形成相對(duì)應(yīng)。無(wú)論供體背景如何，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存在可在數(shù)周培養(yǎng)期內(nèi)維持并增強(qiáng)肝細(xì)胞的完整性、極性及功能。綜上，該全人源三培養(yǎng)體系為研究藥物對(duì)健康及患病供體肝細(xì)胞功能的有效性與潛在毒性，提供了一種具有前景的新型分析工具。
一、全人源TCS體系：研究背景與目的
這項(xiàng)研究旨在開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證一種全人源肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)可長(zhǎng)期維持肝細(xì)胞的表型結(jié)構(gòu)、肝臟基本功能及代謝能力，適用于病理學(xué)與毒理學(xué)研究。有研究表明，利用小鼠3T3成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)可增強(qiáng)細(xì)胞完整性、對(duì)受體激動(dòng)劑的應(yīng)答能力及代謝功能（1-3）。然而，目前仍需要一種全人源且供體匹配的共培養(yǎng)體系，以模擬肝損傷及疾病進(jìn)展過(guò)程中的細(xì)胞間事件。本研究描述了一種全人源肝細(xì)胞三培養(yǎng)體系（TCS），該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了維持來(lái)自多個(gè)供體（代表不同正常和病變肝組織背景）的人類(lèi)肝細(xì)胞批次的結(jié)構(gòu)完整性和基本功能的初步目標(biāo)。
二、全人源TCS體系：肝細(xì)胞培養(yǎng)與功能檢測(cè)方法
1.肝細(xì)胞培養(yǎng)體系
- 單培養(yǎng)樣本制備：將凍存原代人肝細(xì)胞（PHH）以150,000-250,000個(gè)細(xì)胞/cm²的密度（因細(xì)胞批次而異）接種于膠原包被的24孔板中，次日添加基質(zhì)膠覆蓋，構(gòu)建三明治培養(yǎng)體系（Sandwich Culture,SC）。
- 全人源三培養(yǎng)體系（TCS）制備：在膠原包被的24孔板中接種飼養(yǎng)細(xì)胞，于37℃孵育30分鐘后，加入凍存原代人肝細(xì)胞（PHH），接種密度為150,000-250,000個(gè)細(xì)胞/cm²（因細(xì)胞批次而異）。
- 形態(tài)學(xué)評(píng)估：在3-6周培養(yǎng)期內(nèi)觀察各培養(yǎng)模型的細(xì)胞形態(tài)。
- CYP酶誘導(dǎo)活性檢測(cè)：培養(yǎng)1周后，分別用原型受體激動(dòng)劑奧美拉唑（100µM）、CITCO（100nM）或利福平（25µM）處理三明治培養(yǎng)體系（SC）和三培養(yǎng)體系（TCS）中的肝細(xì)胞48小時(shí)，分別誘導(dǎo)CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4酶，采用P450-Glo檢測(cè)試劑盒測(cè)定CYP酶活性。
- 白蛋白與尿素分泌檢測(cè)：在培養(yǎng)24小時(shí)后，使用ELISA試劑盒，在特定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)收集的培養(yǎng)基樣本中的白蛋白和尿素分泌情況。
- 免疫熒光染色：評(píng)估原代人肝細(xì)胞（PHH）簇、飼養(yǎng)細(xì)胞、緊密連接及間隙連接的定位；采用5(6)-羧基-2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（CDFDA）染色驗(yàn)證膽小管的形成及MRP-2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能；使用抗體定位TCS中的牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）。
圖.肝細(xì)胞培養(yǎng)的材料與方法
三、TCS體系：肝細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)及酶活性檢測(cè)結(jié)果
圖1.全人源三培養(yǎng)體系（TCS）示意圖：左側(cè)為自組裝肝細(xì)胞簇的俯視圖，右側(cè)為肝細(xì)胞簇與混合滋養(yǎng)細(xì)胞層整合的側(cè)視圖。
圖2.三培養(yǎng)體系（TCS）中肝細(xì)胞形態(tài)完整性（成簇能力）的維持。每張圖像為同一視野，放大倍數(shù)：100倍。
圖3.培養(yǎng)14天時(shí)三培養(yǎng)體系（TCS）中肝細(xì)胞極性及功能的恢復(fù)。A：白蛋白（ALB，紅色）、CD31（綠色）、DAPI（藍(lán)色）染色；B：功能性膽小管形成（CDFDA染色）；C：緊密連接染色（ZO-1）；D：縫隙連接染色（CX-32）；E、F：乙肝病毒（HBV）受體（NTCP）染色。放大倍數(shù)：A、B、E=100倍；C、D=200倍；F=400倍。
圖4.3名不同供體的原代人肝細(xì)胞（PHH）以單批次或混合批次形式在三培養(yǎng)體系（TCS）中培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)6周的代表性圖像。放大倍數(shù)：100倍。
圖5.在SC和TCS培養(yǎng)體系下，3個(gè)不同PHH批次在培養(yǎng)42天內(nèi)的白蛋白分泌情況。
圖6.3個(gè)不同批次的原代人肝細(xì)胞（PHH）在三明治培養(yǎng)體系（SC）和三培養(yǎng)體系（TCS）中培養(yǎng)35天內(nèi)，利福平誘導(dǎo)的CYP3A4酶活性變化。
圖7.培養(yǎng)第7天，三明治培養(yǎng)體系（SC）與三培養(yǎng)體系（TCS）中CYP酶（CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4）誘導(dǎo)活性對(duì)比。
四、TCS體系肝細(xì)胞培養(yǎng)研究結(jié)論與展望
- 全人源三培養(yǎng)體系（TCS）模擬了關(guān)鍵肝細(xì)胞成分及多細(xì)胞相互作用，可延長(zhǎng)并維持原代人肝細(xì)胞（PHH）培養(yǎng)體系的長(zhǎng)期存活能力、功能完整性及代謝能力。
- 該體系支持化合物及其代謝產(chǎn)物（如活性代謝產(chǎn)物和結(jié)合物）的長(zhǎng)期暴露或重復(fù)暴露實(shí)驗(yàn)。
- TSC適用于代謝譜分析、低代謝化合物清除率檢測(cè)、酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)及肝毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
- 拓展了供體來(lái)源范圍，可納入來(lái)自多數(shù)健康及患病組織（如非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、乙肝相關(guān)肝組織）的原代人肝細(xì)胞（PHH）批次。
參考文獻(xiàn)
- Khetani SR and Bhatia SN (2008) Microscale culture of human liver cells for drug development. Nat Biotechno/26: 120-126.
- Ukairo 0 et al. (2013) Long -term stabiity of primary rat hepatocytes in micropatterned cocultures. J Biochem Mol Toxico/27: 204-212.
- Ukairo O et a. (2013) Bioactivation and toxicity of acetaminophen in a rat hepatocyte micropatemed coculure system. J Biochem Mol Toxico/27: 471-478
拓展閱讀
- 全人源細(xì)胞三培養(yǎng)體系｜形態(tài)、存活時(shí)長(zhǎng)及功能特性表征
- 全人源肝細(xì)胞三培養(yǎng)體系｜CYP450基因誘導(dǎo)潛能表征
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