熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)測(cè)量熒光衰減的空間分布
（論文部分內(nèi)容摘抄）
熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)測(cè)量熒光衰減的空間分布，可以是時(shí)間域的，也可以是頻域的。根據(jù)光探測(cè)器類型和所采用的獲取方法，每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。
熒光通常被用作光致發(fā)光的同義詞，盡管光致發(fā)光通常包括熒光和磷光。這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)都描述了吸收較高能量的光并在隨后以較低能量重新發(fā)射的過(guò)程。本文中，熒光和光致發(fā)光這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可以互換。根據(jù)染料的不同，光子能量的吸收不是瞬時(shí)的。相反，吸收需要一定的時(shí)間，發(fā)射過(guò)程也是如此，即在停止激發(fā)后，染料繼續(xù)發(fā)出光的小段時(shí)間。這種發(fā)射衰減過(guò)程被稱為衰減速率或壽命，是染料及其特定光譜行為的一個(gè)基本特征。
發(fā)射過(guò)程總是可以用隨時(shí)間變化的指數(shù)衰減來(lái)描述，雖然通常需要幾個(gè)指數(shù)因子來(lái)正確描述觀測(cè)到的行為。熒光壽命可以提供有關(guān)染料或其直接環(huán)境的額外信息，這種行為的可預(yù)測(cè)性經(jīng)常被用作傳感應(yīng)用的基礎(chǔ)。
例如，有些熒光染料在激發(fā)后將其多余的能量非光學(xué)地轉(zhuǎn)移到另一個(gè)染料分子(如果它在附近)，從而導(dǎo)致所謂的福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。FRET縮短了衰變速率用于測(cè)量分子之間的相互作用，例如，表明蛋白質(zhì)的二聚化等過(guò)程是細(xì)胞內(nèi)的行為。FRET，作為一種測(cè)量方法，是公認(rèn)的研究細(xì)胞內(nèi)過(guò)程。不幸的是，該用于FRET的兩種染料--能量的供體和接受體--必須具有重疊的光譜特性，才能作為FRET對(duì)。因此，標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)量過(guò)程更加耗時(shí)，因?yàn)楸仨氃谑荏w漂白之前和之后測(cè)量供體熒光，以避免對(duì)FRET 效率進(jìn)行必要的測(cè)量。這種效率是兩個(gè)分子之間距離的一種確定方法。另一種方法是測(cè)量供體熒光壽命，因?yàn)閷⑦@些結(jié)果與對(duì)照實(shí)驗(yàn)的壽命進(jìn)行比較可以提供相同的信息。
熒光通常被用作光致發(fā)光的同義詞，盡管光致發(fā)光通常包括熒光和磷光。這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)都描述了吸收較高能量的光并在隨后以較低能量重新發(fā)射的過(guò)程。本文中，熒光和光致發(fā)光這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可以互換。根據(jù)染料的不同，光子能量的吸收不是瞬時(shí)的。相反，吸收需要一定的時(shí)間，發(fā)射過(guò)程也是如此，即在停止激發(fā)后，染料繼續(xù)發(fā)出光的小段時(shí)間。這種發(fā)射衰減過(guò)程被稱為衰減速率或壽命，是染料及其特定光譜行為的一個(gè)基本特征。
發(fā)射過(guò)程總是可以用隨時(shí)間變化的指數(shù)衰減來(lái)描述，雖然通常需要幾個(gè)指數(shù)因子來(lái)正確描述觀測(cè)到的行為。熒光壽命可以提供有關(guān)染料或其直接環(huán)境的額外信息，這種行為的可預(yù)測(cè)性經(jīng)常被用作傳感應(yīng)用的基礎(chǔ)。
例如，有些熒光染料在激發(fā)后將其多余的能量非光學(xué)地轉(zhuǎn)移到另一個(gè)染料分子(如果它在附近)，從而導(dǎo)致所謂的福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。FRET縮短了衰變速率用于測(cè)量分子之間的相互作用，例如，表明蛋白質(zhì)的二聚化等過(guò)程是細(xì)胞內(nèi)的行為。FRET，作為一種測(cè)量方法，是公認(rèn)的研究細(xì)胞內(nèi)過(guò)程。不幸的是，該用于FRET的兩種染料--能量的供體和接受體--必須具有重疊的光譜特性，才能作為FRET對(duì)。因此，標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)量過(guò)程更加耗時(shí)，因?yàn)楸仨氃谑荏w漂白之前和之后測(cè)量供體熒光，以避免對(duì)FRET 效率進(jìn)行必要的測(cè)量。這種效率是兩個(gè)分子之間距離的一種確定方法。另一種方法是測(cè)量供體熒光壽命，因?yàn)閷⑦@些結(jié)果與對(duì)照實(shí)驗(yàn)的壽命進(jìn)行比較可以提供相同的信息。
自1990年代初以來(lái)，文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了能夠測(cè)量熒光衰減空間分布的基于照相機(jī)的系統(tǒng)。同時(shí)，縮寫FLIM已經(jīng)成為熒光終生成像或熒光終身成像顯微鏡的既定術(shù)語(yǔ)。熒光壽命圖像是如何獲得的？從技術(shù)角度看，這可以在時(shí)間域或頻率域中實(shí)現(xiàn)，每種方法都表現(xiàn)出優(yōu)缺點(diǎn)，這取決于所采用的光探測(cè)器類型和獲取方法。
時(shí)域中的FLIM，激發(fā)停止后隨時(shí)間的熒光的理想響應(yīng)，熒光衰減可通過(guò)多種途徑獲得。內(nèi)源熒光測(cè)量鈴蘭切片樣品(波長(zhǎng)=447納米，調(diào)制=30兆赫)左圖顯示熒光強(qiáng)度。中圖給出基于相位角的熒光壽命分布，使用從500納秒到4納秒的假彩色編碼。右圖顯示與熒光強(qiáng)度加權(quán)后的壽命圖像，使用相同的假彩色編碼。加權(quán)抑制了嘈雜的壽命值。
速度和精度：
圖中使用新型 FLIM 相機(jī)系統(tǒng)得出的第一批結(jié)果表明，在以前無(wú)法實(shí)現(xiàn)的幀速率下，通過(guò)相對(duì)簡(jiǎn)單的設(shè)置，可以以極高的精度測(cè)量非常快速的發(fā)光壽命圖像。這種方法為專家簡(jiǎn)化了過(guò)程，為更常規(guī)的研究采用了該技術(shù)打開了大門，也許會(huì)使熒光壽命領(lǐng)域重新煥發(fā)活力。
德國(guó)Excelitas PCO公司pco.flim 型號(hào)相機(jī)，具備高分辨率、高感光度、弱光成像的優(yōu)點(diǎn)，將顯微研究實(shí)驗(yàn)過(guò)程完美記錄，為實(shí)驗(yàn)提供強(qiáng)而有力的圖像數(shù)據(jù)支持。
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