2026年的今天，生物制藥領(lǐng)域一片蓬勃：?jiǎn)慰寺】贵w（monoclonal antibody，mAb）百花齊放，以單抗為骨架的雙抗、ADC（antibody-drug conjugate，抗體藥物偶聯(lián)物）、AOC（antibody-oligonucleotide conjugate，抗體寡核苷酸偶聯(lián)物）等產(chǎn)品被藥監(jiān)機(jī)構(gòu)大量批準(zhǔn)或處于臨床階段。

然而，這種繁榮其實(shí)只有短短四十年，四十年前生物制藥幾乎還是一片荒漠。就在1986那年，強(qiáng)生公司開發(fā)的第一個(gè)單克隆抗體OKT3獲批上市，正式開啟了抗體藥物的黎明時(shí)代。但當(dāng)時(shí)技術(shù)仍顯稚嫩：抗體篩選高度依賴雜交瘤技術(shù)，基因拷貝數(shù)低，培養(yǎng)基大多含血清，CHO細(xì)胞沒有被大量應(yīng)用，細(xì)胞比生產(chǎn)率（qp）低，峰細(xì)胞密度也不高，積分活細(xì)胞密度（integral viable cell concentration）同樣有限，導(dǎo)致表達(dá)量大多僅維持在10~50 mg/L的水平（Walsh & Walsh, 2022）。表達(dá)量低這一現(xiàn)實(shí)，決定了當(dāng)時(shí)下游純化的主要壓力在于微量抗體的有效捕獲，而上游培養(yǎng)規(guī)模并非主要矛盾。

然而，隨著DHFR（dihydrofolate reductase，二氫葉酸還原酶）和GS（glutamine synthetase，谷氨酰胺合成酶）擴(kuò)增系統(tǒng)的成熟，細(xì)胞株經(jīng)加壓篩選后GOI（gene of interest，目標(biāo)基因）拷貝數(shù)大幅增加；定點(diǎn)轉(zhuǎn)座技術(shù)進(jìn)一步提升了GOI轉(zhuǎn)染效率；培養(yǎng)基也歷經(jīng)迭代，從含血清培養(yǎng)基發(fā)展到含有限蛋白質(zhì)培養(yǎng)基，直至如今占據(jù)主導(dǎo)地位的CD（chemically defined，化學(xué)成分限定）培養(yǎng)基，為精確調(diào)控細(xì)胞培養(yǎng)提供了可能；補(bǔ)料分批培養(yǎng)（Fed-batch）則實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞代謝流的相對(duì)精準(zhǔn)調(diào)控……這些進(jìn)步共同推動(dòng)上游細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)量在過去四十年間實(shí)現(xiàn)了指數(shù)級(jí)躍升。

如今，行業(yè)內(nèi)大多數(shù)抗體滴度已穩(wěn)定達(dá)到5–10 g/L，甚至在強(qiáng)化灌流工藝中逼近20 g/L（Liang et al., 2023）；培養(yǎng)規(guī)模也從2,000 L逐步擴(kuò)大至5,000 L甚至20,000 L。上游產(chǎn)能爆發(fā)極大降低了抗體單位成本，抗體藥物的COG（cost of goods）持續(xù)下降。但與此同時(shí)，下游純化卻面臨巨大壓力。一方面，受限于液體分配和柱管耐壓，工業(yè)上最大層析柱直徑僅兩米，常規(guī)裝填體積不到1,000 L；另一方面，下游自動(dòng)化程度遠(yuǎn)低于上游，大量操作仍需手動(dòng)完成。這兩重限制疊加之下，一個(gè)表達(dá)量為10 g/L的萬升反應(yīng)器，給下游帶來的負(fù)荷可想而知。

Fig.1 典型單克隆抗體下游工藝

典型單克隆抗體下游工藝首先采用蛋白 A 層析進(jìn)行捕獲，隨即進(jìn)行病毒滅活，然后通過兩種不同的純化方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行精純。最后通過納濾步驟實(shí)現(xiàn)病毒去除，同時(shí)對(duì)原液進(jìn)行濃縮與配制。

為了承接住上游細(xì)胞培養(yǎng)越來越高的表達(dá)量和越來越大的培養(yǎng)規(guī)模，下游工藝并沒有停滯不前，而是沿著三個(gè)方向進(jìn)行不斷進(jìn)步：

這一思路簡(jiǎn)單直接且行之有效：既然上游產(chǎn)量大幅提升，下游也需同步升級(jí)，包括擴(kuò)大層析柱直徑以容納更多填料。而更重要的是，在真正起純化作用的填料上下功夫。填料廠商通過幾十年持續(xù)不斷的研發(fā)，不斷對(duì)細(xì)菌的Protein A蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行修飾、替換和重組，不斷刷新動(dòng)態(tài)結(jié)合載量（dynamic binding capacity，DBC）。同時(shí)，對(duì)于填料的基架，也通過不同的技術(shù)手段不斷提高其耐壓性能，使其可以耐受工藝上的高流速，極大的提高了料液處理的通量，大幅縮短工藝時(shí)間，大規(guī)模的節(jié)省了廠房、設(shè)備等的占用，這對(duì)于CDMO公司來說尤為重要，因?yàn)榭梢詳D出更多的Slot（生產(chǎn)時(shí)段）。

博格隆公司Protein A 系列填料經(jīng)過多年的持續(xù)研發(fā)、迭代，搭配耐高壓力的Diamond基架，可保障用戶在更高流速、更短的保留時(shí)間內(nèi)處理完料液，目前有多款商業(yè)化的產(chǎn)品可提供給客戶使用。比如，在確保耐堿性和長(zhǎng)壽命的前提下，新型 Extrem A Diamond 填料，在6min 保留時(shí)間的載量已逼近 80 mg/mL，如 Table 1 所展示。

Table 1. 博格隆 Protein A 系列填料

目前，應(yīng)對(duì)上游高滴度帶來的產(chǎn)能壓力，主流藥企普遍采用是這種提升單位體積效率的策略：通過提高填料載量、縮短保留時(shí)間，來增加每升填料在單位時(shí)間內(nèi)處理的料液量。

連續(xù)生產(chǎn)已廣泛應(yīng)用于石油化工、冶金精煉、汽車制造等眾多行業(yè)。近年來生物制藥行業(yè)也開始加大對(duì)連續(xù)生產(chǎn)的探索，美國(guó)FDA在2019年發(fā)布官方聲明推動(dòng)生物制藥的連續(xù)制造，并頒布了質(zhì)量控制指南。目前，連續(xù)灌流細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)得到突破，并逐漸普及。在上游培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)連續(xù)化的情況下，下游分離純化就成為整個(gè)生產(chǎn)過程的關(guān)鍵限速步驟。因此，這一方向的核心是：與其單純擴(kuò)大柱體積，不如采用小體積柱子，最大限度利用填料每一份載量，并提升周轉(zhuǎn)速率。

這個(gè)思路之所以可行，是因?yàn)閭鹘y(tǒng)柱層析留下的bug：填料實(shí)際上樣的載量低于飽和載量。其原理可簡(jiǎn)述如下：Fig.2(a)為典型的抗體穿透曲線，為避免產(chǎn)品損失，常規(guī)柱層析通常在較低穿透點(diǎn)上樣（常按10%穿透載量再打八折）。例如，若測(cè)得10%穿透載量為100 mg/mL，工藝中實(shí)際使用載量可能僅為80 mg/mL。此時(shí)填料并未完全飽和，利用率一般僅為50%~60%，相當(dāng)于Fig.2(a)中僅利用了A部分載量，造成Protein A填料的浪費(fèi)。為提升填料利用率，可將單柱批次模式（Fig.2(b)）轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘀�串�?lián)連續(xù)上樣模式（Fig.2(c)）：柱1穿透的抗體被后續(xù)柱2捕獲，持續(xù)上樣至?xí)r間t₂，此時(shí)柱1填料載量達(dá)到（A+B），利用率可優(yōu)化至90%以上；柱1吸附完成后，與柱2斷開，料液切換至柱2繼續(xù)上樣，而柱1則依次進(jìn)行沖洗、洗脫、再生和平衡，隨后重新串聯(lián)，循環(huán)操作，從而實(shí)現(xiàn)料液連續(xù)上樣（Jing et al., 2021; Steinebach et al., 2016）。

Fig.2 連續(xù)捕獲層析原理圖

目前市場(chǎng)上有多種連續(xù)流設(shè)備及其控制、模擬系統(tǒng)，實(shí)際操作遠(yuǎn)比上述簡(jiǎn)化原理復(fù)雜（Jing et al., 2021）。

Table 2. 蛋白捕獲階段各類連續(xù)流設(shè)備匯總

整體來說，連續(xù)流層析模式較多，操作復(fù)雜，過程參數(shù)多，優(yōu)化設(shè)計(jì)較為困難；在連續(xù)流處理中，料液連續(xù)輸入，產(chǎn)品連續(xù)輸出，其中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都將是災(zāi)難性的，這些是其目前未能大規(guī)模應(yīng)用的主要障礙（Jing et al., 2021; Steinebach et al., 2016）。

對(duì)流速的極致追求，造就了膜層析。這就是第三個(gè)解決思路：若無法進(jìn)一步提升單品載量或運(yùn)轉(zhuǎn)效率，那就全力加快處理速度。膜層析(membrane chromatography)的基質(zhì)通常是堆疊的多孔薄膜，厚度通常在毫米級(jí)，膜上修飾有特定的配基（如陰離子交換配基Q）。料液在壓力驅(qū)動(dòng)下以高流速通過膜孔道。傳統(tǒng)柱層析依賴填料顆粒內(nèi)部的擴(kuò)散傳質(zhì)（diffusion），單抗等大分子需要較長(zhǎng)時(shí)間才能擴(kuò)散到配基結(jié)合位點(diǎn)；膜層析利用對(duì)流傳質(zhì)（convection）機(jī)制，目標(biāo)分子在流動(dòng)過程中直接與膜孔道表面的配基快速接觸并結(jié)合，幾乎無需依賴緩慢的分子擴(kuò)散，這就可將原本數(shù)小時(shí)的柱層析縮短至分鐘級(jí)（Boi et al., 2020）。

盡管膜層析和連續(xù)流制造近些年被炒得火熱，但在真實(shí)的工業(yè)生產(chǎn)線，尤其是 2000L 以上規(guī)模中，傳統(tǒng)柱層析依然穩(wěn)如泰山。其原因在什么地方呢？

膜層析在捕獲（如單抗的Protein A親和捕獲）時(shí)，膜的有效結(jié)合面積遠(yuǎn)不及具有深邃孔徑結(jié)構(gòu)的傳統(tǒng)填料。傳統(tǒng)填料顆粒（beads）通過內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)，提供巨大比表面積，結(jié)合位點(diǎn)豐富，載量更高，例如博格隆公司Diamond Q的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量出廠標(biāo)準(zhǔn)大于100 mg/mL。而膜層析主要依賴表面吸附，單位體積可用結(jié)合位點(diǎn)較少，動(dòng)態(tài)結(jié)合載量通常僅為填料的30–60%。Boi et al. (2020)的直接對(duì)比實(shí)驗(yàn)（相同3 mL體積、相同Q配基）顯示，在相同的流速下，柱層析的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量（10%穿透）為62.8 mg/mL，而膜層析僅為20.7 mg/mL。這意味著要達(dá)到同等載量，膜需顯著增加體積或?qū)訑?shù)，從而大幅推高單次投入的膜材料成本。

膜層析通常設(shè)計(jì)為一次性使用或僅能使用數(shù)次。這雖然避免了傳統(tǒng)填料所需的清洗、再生及潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)，但也帶來了較高的初始材料成本，攤銷后難以與Protein A填料競(jìng)爭(zhēng)。相比之下，填料具有良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，可重復(fù)使用多次，其成本得以分?jǐn)�，從而顯著降低了每克產(chǎn)品的純化成本。

Fig.3 博格隆公司親和填料使用次數(shù)超過數(shù)百次

抗體的質(zhì)量控制對(duì)電荷異質(zhì)性（酸性/堿性變體）和聚集體的去除要求極為嚴(yán)苛。這些雜質(zhì)直接影響產(chǎn)品純度、安全性和療效。以填料為核心的柱層析憑借較高的柱床和數(shù)千個(gè)理論塔板數(shù)（N），顯著提升分辨率（Rs），分辨率公式如下：

其中，N（理論塔板數(shù)）是柱效的核心，Rs與N的二次方根成正比。常規(guī)的長(zhǎng)柱床使N大幅增加，從而實(shí)現(xiàn)精細(xì)的梯度洗脫，有效分辨細(xì)微的電荷差異或大小/疏水性差異，高效去除目標(biāo)雜質(zhì)。

相比之下，膜層析流路極短，通常僅數(shù)毫米，雖然傳質(zhì)快，但有效分離路徑有限，理論塔板數(shù)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)柱，難以提供高分辨率的梯度洗脫效果，尤其在精細(xì)分離電荷異質(zhì)性和聚集體時(shí)表現(xiàn)受限，這從底層限制了膜層析的應(yīng)用范圍和規(guī)模。

盡管連續(xù)流層析與膜層析在通量和工藝集成上確實(shí)優(yōu)勢(shì)明顯，但在真實(shí)的工業(yè)規(guī)�？贵w純化中，上游滴度已躍升至10 g/L以上，培養(yǎng)規(guī)模也達(dá)到了萬升級(jí)別。面對(duì)這樣的挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)柱層析擁有遠(yuǎn)高于膜層析的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量，可重復(fù)使用數(shù)百次的長(zhǎng)壽命，以及柱床提供的數(shù)千理論塔板數(shù)所賦予的高分辨率，依然是保障高純度、低成本與工藝穩(wěn)健性的核心基石。

[1]Steinebach F et al. Continuous counter-current chromatography for capture and polishing steps in biopharmaceutical production. Biotechnology Journal, 2016.

[2]Boi C et al. A direct comparison between membrane adsorber and packed column chromatography performance. Journal of Chromatography A, 2020.

[3]Jing S et al. 連續(xù)流層析及用于抗體分離的新進(jìn)展. 高�；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào), 2021.

[4]Walsh G, Walsh E. Biopharmaceutical benchmarks 2022. Nature Biotechnology, 2022.

[5]Liang et al. Enhancing and stabilizing monoclonal antibody production by Chinese hamster ovary (CHO) cells with optimized perfusion culture strategies. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2023.