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圖1. MSC-EVs角膜神經(jīng)再生研究實驗流程示意圖。
a）2D/3D體系擴增角膜/骨髓來源MSCs，完成EVs提取與多維度表征；
b）體外驗證EVs對TgV1神經(jīng)元神經(jīng)突生長的促進作用；
c）體內(nèi)驗證EVs在角膜損傷模型中的神經(jīng)再生修復(fù)效能。

2.3  EVs的分離與全面表征
兩組培養(yǎng)體系的分泌組均先經(jīng)梯度離心預(yù)處理，500×g離心15分鐘去除細(xì)胞，2000×g離心10分鐘去除細(xì)胞碎片；隨后分別采用超速離心法和商業(yè)化沉淀試劑盒兩種方法分離EVs，為保證EVs完整性，后續(xù)實驗選用商業(yè)化試劑盒分離的產(chǎn)物。

表征環(huán)節(jié)通過多維度檢測完成，核心檢測項目包括：
•   納米顆粒跟蹤分析（NTA）檢測EVs的顆粒濃度與尺寸分布；
•   ExoView分析CD9、CD81、CD63等四跨膜蛋白表達特征；
•   蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）驗證外泌體標(biāo)志物ALIX、細(xì)胞污染標(biāo)志物Calnexin等蛋白表達，確認(rèn)EVs純度；
•   透射電子顯微鏡（TEM）：觀察EVs的形態(tài)特征。

2.4  EVs神經(jīng)再生功能驗證
2.4.1  體外功能驗證
分離4-6周齡小鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（TgV1），接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿，待出現(xiàn)初始神經(jīng)突生長后，加入不同組別EVs（終濃度2×10⁹個/培養(yǎng)皿），培養(yǎng)48小時后，通過βIIItubulin免疫熒光染色，結(jié)合Neurolucida軟件定量分析神經(jīng)突長度，并通過GAP-43染色檢測神經(jīng)再生芽生情況。

2.4.2  體內(nèi)功能驗證
構(gòu)建10-12周齡小鼠2mm角膜上皮清創(chuàng)損傷模型，對損傷眼結(jié)膜下注射5μL EVs（含2×10⁹個顆粒），設(shè)置空白培養(yǎng)基組為對照；術(shù)后14天解剖小鼠角膜，經(jīng)免疫熒光染色后，量化角膜中心1mm區(qū)域的神經(jīng)長度；同時采用vonFrey細(xì)絲檢測角膜眨眼閾值，評估角膜感覺神經(jīng)的功能恢復(fù)情況。

2.5  分子機制探究
對不同培養(yǎng)體系、不同組織來源的EVs進行小RNA測序，分析其miRNA表達譜，篩選差異表達miRNA；通過RT-qPCR驗證關(guān)鍵miRNA的表達水平，并結(jié)合靶基因預(yù)測與通路富集分析，探究EVs調(diào)控角膜神經(jīng)再生的分子機制；同時檢測TgV1神經(jīng)元中神經(jīng)再生相關(guān)基因的表達，驗證通路調(diào)控作用。

三、核心結(jié)果：3D培養(yǎng)體系對MSC-EVs產(chǎn)量與再生效能的關(guān)鍵影響
Part2-該研究通過多維度檢測，客觀呈現(xiàn)了PBS反應(yīng)器3D培養(yǎng)體系在MSC-EVs制備中的表現(xiàn)與優(yōu)勢，核心試驗結(jié)果均以定量數(shù)據(jù)呈現(xiàn)，具體如下：

3.1  3D培養(yǎng)提升MSC-EVs的產(chǎn)量與優(yōu)質(zhì)顆粒占比
NTA檢測結(jié)果顯示，3D培養(yǎng)體系的EVs顆粒濃度明顯高于2D培養(yǎng)，核心數(shù)據(jù)如下：
•  3D-BM-MSC-EVs顆粒濃度：(1.03±2.72)×10¹¹個/mL
•  3D-Co-MSC-EVs顆粒濃度：(8.64±1.96)×10¹⁰個/mL
•   2D-BM-MSC-EVs顆粒濃度：(5.37±1.35)×10⁹個/mL
•   2D-Co-MSC-EVs顆粒濃度：(1.41±1.32)×10¹⁰個/mL

兩組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。

粒徑分布分析顯示，所有組別EVs中80%以上顆粒直徑小于200nm，符合外泌體典型尺寸范圍；其中3D培養(yǎng)組的小尺寸顆粒占比更高，3D-BM-MSC-EVs為88.3%±4% ，3D-Co-MSC-EVs為91.0%±2%。

圖2. MSC-EVs的分離方法對比與多維度表征結(jié)果。

a）分離方法對比：超速離心法（UC）獲得的EVs產(chǎn)量更高，但與商業(yè)化沉淀試劑盒相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；
b）小尺寸EVs富集效果：商業(yè)化試劑盒分離的<200nm小尺寸EV占比更高，其中角膜來源EVs（CoEVs）組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，骨髓來源EVs（BMEVs）組無明顯差異；
c）培養(yǎng)維度對產(chǎn)量的影響：納米顆粒跟蹤分析（NTA）顯示，3D培養(yǎng)來源EVs的顆粒濃度高于2D培養(yǎng)組（p<0.05），證實3D培養(yǎng)可提高EVs產(chǎn)量；
d）粒徑分布特征：四個EVs實驗組中，超80%的顆粒直徑小于200nm，符合外泌體的典型尺寸范圍；
e）FTLA分析：所有EVs樣本的濃度/粒徑分布趨勢一致，峰值均低于200nm；
f）各組間單位細(xì)胞產(chǎn)生的EVs數(shù)量無明顯差異，實驗分組間具備可比性；
g）EVs純度驗證：Western blot結(jié)果顯示，EVs組分富集外泌體標(biāo)志物ALIX，未檢出細(xì)胞污染標(biāo)志物Calnexin與GAPDH，而母細(xì)胞裂解液中可檢出上述三種蛋白，證實EVs純度達標(biāo)；
h）NTA可視化結(jié)果：3D培養(yǎng)來源EVs的顆粒濃度高于2D組，空白收集培養(yǎng)基（CM）中僅檢出少量顆粒；
i）形態(tài)學(xué)驗證：所有EVs組的透射電子顯微鏡（TEM）圖像證實，存在具有外泌體典型杯狀和球形形態(tài)的納米顆粒。

注：圖中誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）；星號表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；每組設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)；比例尺=200nm。

3.2  3D來源EVs體外促神經(jīng)再生效果優(yōu)于2D組
體外實驗結(jié)果證實，3D培養(yǎng)體系來源的EVs促進TgV1神經(jīng)元神經(jīng)突生長的效果更明顯

3D-Co-MSC-EVs處理組神經(jīng)突長度為12.64±1.5mm，3D-BM-MSC-EVs處理組為10.21±1.24mm，均明顯高于對應(yīng)的2D培養(yǎng)組（2D-Co-MSC-EVs組5.3±0.58mm、2D-BM-MSC-EVs組3.0±0.32mm），且p<0.05；同時3D-EVs處理組的GAP-43陽性信號更強，神經(jīng)再生芽生更活躍。

圖3. MSC-EVs對三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元神經(jīng)突生長的體外功能驗證。

a）明場圖像展示了處理前（培養(yǎng)至第2天）的神經(jīng)突生長狀態(tài)；
b）處理48小時后的20倍明場圖像顯示，3D培養(yǎng)來源EVs處理組的神經(jīng)元神經(jīng)突生長，優(yōu)于2D培養(yǎng)來源EVs處理組及各對照組；
c）β-Ⅲ微管蛋白熒光成像進一步證實，3DEV處理組的神經(jīng)生長情況優(yōu)于2DEV組與空白對照組；
d-f）Neurolucida定量分析結(jié)果顯示，無論是角膜來源（CoEVs）還是骨髓來源（BMEVs）的EVs，3DEV處理組的神經(jīng)突伸長量均高于對應(yīng)的2DEV處理組；
g）GAP-43免疫熒光成像顯示，3DEV處理組的神經(jīng)再生相關(guān)信號強于2DEV處理組與空白培養(yǎng)基（CM）對照組。

3.3  3D來源EVs體內(nèi)角膜神經(jīng)修復(fù)與功能恢復(fù)效果更突出
術(shù)后14天，3D-EVs處理組小鼠角膜神經(jīng)再生與功能恢復(fù)均優(yōu)于2D組及空白對照組，3D-Co-MSC-EVs組角膜神經(jīng)長度為51.9±9.1mm，3D-BM-MSC-EVs組為42.2±3.5mm，高于對照組的23.3±1.2mm（p<0.01）；角膜敏感性檢測中，3D-EVs處理組的眨眼閾值明顯低于對照組，表明感覺神經(jīng)功能恢復(fù)更理想。

圖4. MSC-EVs在小鼠角膜損傷模型中的體內(nèi)神經(jīng)再生與功能恢復(fù)效果驗證，角膜清創(chuàng)及治療注射后2周，通過βIIITubulin抗體染色結(jié)合Neurolucida分析評估神經(jīng)再生情況

a）對角膜中央1mm區(qū)域的神經(jīng)纖維密度進行定量分析；（a插圖）小圖為再生神經(jīng)的代表性追蹤結(jié)果，采用NeurolucidaExplorer軟件進行彩色標(biāo)記和測量。
b）與2DCoEV）處理組及對照組相比，3DCoEVs處理組的角膜神經(jīng)生長增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
c）與2DBMEVs處理組及對照組相比，3DBMEVs處理組的角膜神經(jīng)生長明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
d）CoEVs處理組的角膜神經(jīng)再生效果略優(yōu)于BMEVs處理組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
e）采用馮・弗雷細(xì)絲（vonFreyhairfilaments）評估角膜神經(jīng)功能：眨眼閾值越高表明敏感性越低；對照組角膜的眨眼閾值高，而3DCoEVs處理組的角膜敏感性好；所有EVs處理組的角膜敏感性均優(yōu)于對照組。采用雙尾獨立樣本t檢驗評估不同處理對損傷角膜神經(jīng)再生的統(tǒng)計學(xué)影響；比例尺=1000μm；每組條件設(shè)4個生物學(xué)重復(fù)；CM代表未處理收集培養(yǎng)基。

3.4  培養(yǎng)維度改變EVs的miRNA表達譜
小RNA測序顯示，3D培養(yǎng)明顯改變了EVs的miRNA表達譜，3D-BM-MSC-EVs中hsa-miR-128-3p、hsa-miR-409-3p等神經(jīng)營養(yǎng)相關(guān)miRNA高表達，3D-Co-MSC-EVs中則富集調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)重塑的miRNA；且3D培養(yǎng)降低了不同組織來源EVs的miRNA表達異質(zhì)性。RT-qPCR驗證顯示，3D-EVs處理能明顯上調(diào)TgV1神經(jīng)元中神經(jīng)突生長、突觸形成及基質(zhì)重塑相關(guān)基因的表達。

圖5. 不同組織來源及培養(yǎng)條件下MSC-EVs的miRNA表達譜特征。

a）柱狀圖顯示2D和3D培養(yǎng)的BM-MSC及Co-MSC來源EVs中，共有的20種高豐度表達miRNA。
b）2D CoEVs與2D BMEVs的對比分析顯示，差異表達的miRNA數(shù)量多，表明二維培養(yǎng)條件下不同組織來源EVs的分子差異明顯。
c）3D CoEVs與3D BMEVs的對比分析顯示，差異表達miRNA數(shù)量大幅減少，表明三維培養(yǎng)條件下不同組織來源EVs的分子相似性更高。
d）3D BMEVs與2D BMEVs的對比分析顯示，部分miRNA明顯上調(diào)，表明培養(yǎng)維度對BMEVs的內(nèi)容物組成影響突出。
e）相反，3D CoEVs與2D CoEVs的對比分析僅發(fā)現(xiàn)1種miRNA（hsa-miR-159）表達明顯改變，表明角膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源EVs的內(nèi)容物組成在不同培養(yǎng)維度下相對穩(wěn)定。
f）miRNA表達熱圖顯示，樣本按培養(yǎng)條件呈明顯聚類，且3D培養(yǎng)組的組織特異性差異較2D培養(yǎng)組有所降低。

四、研究價值與產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化意義
本研究通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼炘O(shè)計，系統(tǒng)證實了PBS垂直輪式生物反應(yīng)器的3D培養(yǎng)體系在MSC-EVs制備中的核心應(yīng)用價值：其低剪切力的流體動力學(xué)設(shè)計構(gòu)建的仿生微環(huán)境，既保證了細(xì)胞活性，又優(yōu)化了EVs的產(chǎn)量與功能；同時明確了組織來源對EVs治療效能的影響，為角膜神經(jīng)再生的EVs療法優(yōu)化提供了直接的試驗依據(jù)。值得注意的是，研究中細(xì)胞擴增與EVs收集全程采用RoosterBio專用培養(yǎng)基，其化學(xué)成分限定的無血清配方，為試驗結(jié)果的可靠性與后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化提供了保障。

曼博生物作為PBS Biotech、RoosterBio和IZON Science官方供應(yīng)商，致力于將這類經(jīng)過科研驗證的優(yōu)質(zhì)生物工藝解決方案引入國內(nèi)，為再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究與產(chǎn)業(yè)化提供有力支持。

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