免疫細胞培養(yǎng)的六個基本流程：樣本制備、細胞分選、分型鑒定、擴增&培養(yǎng)、質量優(yōu)化、后續(xù)研究。10月7日，小優(yōu)給大家詳細分享了《免疫細胞培養(yǎng)通關技巧之樣本制備》，今天繼續(xù)通關第二關：細胞分選。
 

細胞分選（Cell Sorting）：根據(jù)細胞所具有的特性把某種特定的細胞亞群從混合的細胞樣品中分離出來的一種技術，它是對某一特定細胞進行生化分析和功能分析的前提和基礎。
 

在進行細胞分選前，我們要明確目的細胞占比、標記物、選擇何種分選方法。
 

目的細胞占比：不僅涉及到樣本的選擇，也關乎我們是否進行樣本的預富集，這部分內容我們在樣本制備篇章已經給大家列舉出來了。
 

免疫細胞標記物：人免疫細胞分型標記物圖譜基本上涵蓋了所有的免疫細胞及鑒定標記物，需要的小伙伴快快拿走！

 

圖1 人免疫細胞分型標記物圖譜

 

目前細胞分選的常規(guī)方法分為四種：磁珠分選（Magnetic Cell Separation）、流式分選（Fluorescence-activated Cell Sorting）、免疫密度梯度細胞分選（Immunodensity Cell Isolation）、微流控細胞分選（Microfluidic Cell Sorting）。小優(yōu)在這里也給大家匯總了四種方法的原理以及優(yōu)缺點。

 

表1 四種細胞分選方法的比較

 

由于磁珠分選和流式分選是現(xiàn)在細胞分選最常用的，接下來給大家詳細介紹這兩種方法的分選策略。

 

圖2 磁珠分選（左）、流式分選（右）原理示意圖（圖片來源網(wǎng)絡）

 

磁珠分選的分選策略：陽性分選、陰性分選、多重分選、全血分選。
 

陽性分選：目的細胞被磁珠標記后，作為陽性組分直接分選出來。分選后的細胞不必去除MACS微珠，可立即用于培養(yǎng)或者后續(xù)操作。該方法可以將磁性標記的靶細胞富集10000倍。陽性分選的純度更好，尤其是針對某些需要富集的稀有細胞，回收率也更高。

 

圖3 磁珠分選中陽性分選示意圖（圖片來源Miltenyi官網(wǎng)）

 

陰性分選：磁性標記非目的細胞，將其從細胞混合物中去除，即為磁性標記的細胞為目的細胞，陰性分選也稱為去除分選。
 

適用范圍：去除不需要的細胞；缺乏針對目的細胞的特異性抗體(如腫瘤細胞)；不需要抗體和目的細胞結合，即細胞不被激活(如T細胞、B細胞、NK細胞功能分析)。

 

圖4 磁珠分選中陰性分選示意圖（圖片來源Miltenyi官網(wǎng)）

 

多重分選：有兩種方案：方案一：陰性分選+陽性分選，即先去除部分非目的細胞，再進行陽性分選；方案二：多選磁珠+陽/陰性分選，即先用多選磁珠陽性分選細胞，剪切去除磁珠后，再對分選的細胞進行二次分選；或者直接使用Miltenyi可自動解離的REAlease磁珠，無需手動剪切，即可進行二次分選。
 

適用范圍：在細胞懸液中，非目的細胞也表達用來陽性選擇目的細胞的抗原，就需要先去除這群非目的細胞，或者選擇多選磁珠/REAlease磁珠，解離細胞表面的磁珠后，再對分選后的細胞進行二次分選；如果要分選非常稀有細胞，先從細胞懸液中去除非目的細胞，在富集細胞的基礎上，進行陽性分選，可獲得高純度目的細胞。

 

圖5 磁珠分選中多重分選示意圖（上：陰性分選+陽性分選；下：多選磁珠+陽/陰性分選）（圖片來源Miltenyi官網(wǎng)）

 

全血分選：傳統(tǒng)方法從外周血中分選細胞，需要先制備PBMC，再進行后續(xù)的磁珠分選或者流式分選，操作時間長達2 h。美天旎含有一款全血磁珠，無需裂解紅細胞，無需密度梯度離心，30 min之內即可獲得活性好、得率高的目的細胞。

 

圖6 磁珠分選中全血分選示意圖（圖片來源Miltenyi官網(wǎng)）

 

流式分選的分選策略：流式分選的步驟相對來說比較固定：1.制備單細胞懸液；2.細胞染色；3.細胞分選；4.后續(xù)細胞培養(yǎng)、分析。

 

圖7 流式分選的基本步驟 （圖片來源網(wǎng)絡）

 

其中比較困難的就是關于抗體偶聯(lián)熒光素的選擇，很多老師會遇到這種情況，確定好了要分選的細胞的marker，但是偶聯(lián)的熒光素不知道怎么選。一般來說需要遵循三個原則：

1.根據(jù)儀器配置選擇熒光素：多色標記熒光素搭配時還應當每個通道只選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以互相搭配；

2.根據(jù)抗原表達強弱合理分配熒光素：即抗原為高表達的話，可以將其與熒光強度較低的熒光素抗體相結合；

3.選擇光譜重疊小的熒光素：由于熒光素的寬發(fā)射譜的特點，熒光通道間有光譜重疊現(xiàn)象，因此選擇熒光素組合時要將光譜疊加可能性減到最低。多色流式實驗的時候往往需要通過補償調節(jié)消除光譜重疊的影響。

 

圖8激發(fā)光及對應熒光素介紹（圖片來源優(yōu)寧維）

 

這里給大家匯總一些流式分選的tips：

• 因為分選得到的細胞還要繼續(xù)培養(yǎng)，所以務必保證樣本的無菌狀態(tài)；
• 不能使用固定劑固定細胞，因為活細胞經固定劑處理后即死亡；
• 細胞重懸液中加入PH調節(jié)劑HEPES（終濃度25mM，PH調節(jié)范圍6.8-8.2），減少高壓對PH的改變；
• 鞘液中避免含有抑菌劑，如乙醇胺類物質，以免影響細胞活性；
• 如細胞分選后需再次培養(yǎng)，需準備含血清的收集管；保證分選完畢時血清濃度大于5%；
• 如要去除死細胞，在不影響后續(xù)實驗前提下，可加入7-AAD、PI或DAPI；

當然，磁珠分選和流式分選也不是完全獨立的，我們也可以先選擇美天旎磁珠進行陽性分選，富集目的細胞之后，再標記對應的流式抗體進行進一步的流式分選。這種方法的適用范圍主要是低頻稀有細胞，希望獲得更高的純度。

 

了解了兩大常用的細胞分選方法后，我們應當如何選擇呢？

流式分選可進行多參數(shù)分選以及不同熒光強度的分選，但對設備要求較高，對細胞刺激較大但分選靈活可以達到多方面的分選要求；磁珠分選操作簡單，分選速度快，細胞活性好，對設備和技術員的要求較低，但只能根據(jù)一個參數(shù)進行分選，而且也不能針對細胞胞內標記物進行篩選。這里小優(yōu)也給大家詳細對比了流式分選和磁珠分選的優(yōu)劣勢：

 

圖9流式分選與磁珠分選的比較（圖片來源優(yōu)寧維）

 

一般來說，如果磁珠分選能達到研究要求，一般首選磁珠分選，若磁珠分選達不到要求則再考慮用流式進行分選。
 

最后以磁珠分選PBMCs樣本中人Tregs細胞為例，幫助大家更好的get要點：

Tregs是CD4+ T細胞的一個亞群，它最特異性的標簽是核內轉錄因子Foxp3，此外，它還高表達IL-2α受體(IL2Rα)—CD25，因此，經典的Treg標志是CD4+ CD25+ Foxp3+ T。如果我們檢測Tregs細胞，可以選擇膜標記及核標記同時鑒定，但如果我們需要分選Tregs細胞并進行后續(xù)的培養(yǎng)，那就無法借助核轉錄因子Foxp3了，因為磁珠分選只能進行膜蛋白的標記，流式分選標記Foxp3時，需要固定、透化步驟，會導致細胞死亡。所以分選Tregs細胞選擇的標記物一般為：表面蛋白CD4、CD25。

好啦，免疫細胞培養(yǎng)通關技巧之細胞分選的內容也給大家介紹完了，下一個分型鑒定，我們不見不散呀！