肉類顏色測量指南之肉色研究方法G-J
G.分離肌紅蛋白用于體外研究
原則：
純化肌紅蛋白有時是必要的，例如用于比較 不同物種 肌紅蛋白（Mb）的自氧化速率。 肌紅蛋白（分子量 約 16,949）可以從骨骼肌或心肌中輕松純化 。其紅色便于在層析過程中直觀觀察。該方法使用相對廉價的設(shè)備即可獲得較高產(chǎn)率的肌紅蛋白（Faustman和Phillips，2001；改編自Wittenberg和Wittenberg，1981年以及Trout和Gutzke，1996年的早期方法）。
樣品、試劑和溶液
1. 去脂去筋的牛肉塊
2. 均質(zhì)化緩沖液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C
3. 氫氧化鈉
4. 硫酸銨
5. 透析緩沖液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C
6. 色譜洗脫緩沖液（5 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.5）在4 °C
記下
為了將亞鐵肌紅蛋白的形成降至最低，均質(zhì)化和所有后續(xù)步驟應(yīng)在0至5 ° C和高pH（8.0至8.5）下進行。
設(shè)備
攪拌器、紗布、 4℃ 下 20,000×g 轉(zhuǎn)速離心機、透析管（分子量截留值12 ，000至14 ，000）、 Sephracryl S - 200HR色譜柱（30× 2.5至cm）、蠕動泵。需要額外試劑和設(shè)備來測定蛋白質(zhì)濃度，或 基于其消光系數(shù)計算肌紅蛋白濃度 。
制備勻漿
1. 將150克切碎的肌肉與450毫升勻漿緩沖液放入攪拌機中進行勻漿處理高速運轉(zhuǎn)1至2分鐘。
2. 將勻漿液均等分裝至各試管中， 在4℃ 下以3000× g 離心10分鐘。
3. 棄去池上清液， 用氫氧化鈉 調(diào)節(jié)所得上清液的pH至8.0。
4. 用兩層紗布過濾上清液，以去除脂質(zhì)和結(jié)締組織顆粒。
沉淀肌紅蛋白
1. 將濾液飽和至70%硫酸銨濃度（472克硫酸銨/升濾液），用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0，
攪拌1小時。
2. 將勻漿液均等分裝至各試管中，4℃條件下以18,000× g 離心20分鐘，去除沉淀蛋白。
3. 合并上清液，棄去沉淀。
4. 將上清液從70%濃度調(diào)整至100%硫酸銨飽和度（通過添加（上清液中額外添加228克硫酸銨/L），用 氫氧化鈉 調(diào)節(jié)pH至8.0， 并攪拌1小時 。
5. 將勻漿液均分至各試管中，隨后以1000×g離心1小時。20,000 × g ，4 ° C。棄去上清液，加入1或2 mL冰冷卻緩沖液以幫助沉淀物的回收。
透析和純化肌紅蛋白
1. 將沉淀的肌紅蛋白轉(zhuǎn)移至透析管中，并在4 ° C下使用透析緩沖液（1體積蛋白質(zhì)，10體積緩沖液）透析24小時，每8小時更換緩沖液。
2. 使用蠕動泵 ，用色譜洗脫 緩沖液（3個色譜柱體積）平衡Sephacryl S-200 HR色譜柱。
3. 將透析液加入色譜柱，以60mL/小時的流速用色譜洗脫緩沖液洗脫肌紅蛋白提取物。該步驟將血紅蛋白與肌紅蛋白分離。血紅蛋白將首先洗脫為淡紅色/棕色條帶。肌紅蛋白隨后作為 明顯可見的深紅色條帶洗脫。
4. 使用分餾收集器收集含肌紅蛋白的餾分。
肌紅蛋白濃縮物
1. 將所有含肌紅蛋白的組分進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用天然聚丙烯酰胺凝膠電泳法可評估肌紅蛋白提取物的純度， 該提取物應(yīng)產(chǎn)生一條分子量為17kDa的單一蛋白條帶 。
2. 使用離心濃縮器濃縮肌紅蛋白溶液。
3. 或者（步驟2的替代方案），將肌紅蛋白溶液飽和至100%硫酸銨濃度（761克硫酸銨/升溶液），將pH調(diào)節(jié)至8.0，攪拌溶液1 小時 。 將溶液均分至各試管中，并在4°C下以20,000×g離心1小時 ， 000×g g 。 排棄上清液，并按前述方法透析肌紅蛋白 。
4. 或者（步驟2和3），肌紅蛋白可通過 Trout和Gutzke（1996）所述 的超濾法濃縮。
5. 測定肌紅蛋白溶液的蛋白質(zhì)濃度，并分裝至 -80℃ 冷凍保存。
記下
這種肌紅蛋白分離程序的產(chǎn)量相對較低，需要2到3個月的 收集才能得到大量的 肌紅蛋白。
參考文獻
Faustman，C.和A. Phillips. 2001.新鮮肉變色的測量. 《食品分析化學(xué)最新協(xié)議》 第F3.3單元，S.J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.，紐約。
特勞特，G.R.和D.A.古茲克。1996年。一種簡單、快速的制備方法，用于分離和純化氧肌紅蛋白。肉類科學(xué)43 ：1- 13 。
Wittenberg，J. B.和B. A. Wittenberg. 1981.肌紅蛋白的制備. Methods Enzymol. 76 ：29–42.
H.從牛骨骼肌中分離線粒體
原則
線粒體分離包含三個步驟：細胞裂解、勻漿和離心。使用蛋白酶處理骨骼肌可顯著促進線粒體釋放，同時提高產(chǎn)量。
試劑
1. 1 M蔗糖：將342.3 g蔗糖溶于1 L蒸餾水中，混勻，分裝成20 mL等分試樣， 于-20℃ 保存。
2. 0.1 M Tris/MOPS：將12.1克Tris[三（羥甲基）氨基甲烷]溶解于500 mL 蒸餾水中 ， 調(diào)節(jié)pH 至7 。 使用MOPS [ 3 -（N -嗎啉代）丙磺酸]粉末，將溶液定容至1 L，并于4 ° C保存。
3. 1 M Tris/鹽酸：將121.14 g Tris溶于500 mL蒸餾水中， 用鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7.4 ， 將溶液稀釋至1 L并室溫保存 。
4. 1 M EDTA：將372.2 g EDTA（乙二胺四乙酸）溶于500 mL 蒸餾水中，并于4℃保存 。
5. 10% BSA：將10 g BSA（牛血清白蛋白）溶于100 mL蒸餾水中， 存放于-20℃ 。
7. 10mMEDTA：將2.92gEDTA溶于1L蒸餾水中，并于4℃ 保存 。
8. 0.5%BSA：將5 g BSA溶于1 L蒸餾水中，并于-20 °C 下保存。
9. 納加酶：配制20毫克/100毫升分離液濃度的納加酶溶液（即20毫克/100毫升）。
重要提示： 其他蛋白酶（胰蛋白酶）的選擇取決于研究者偏好和方案，以及用于分離線粒體
的肌肉類型。
關(guān)鍵步驟3： 實驗當(dāng)天制備所有緩沖液，以避免儲存的緩沖液中細菌/酵母生長。
關(guān)鍵步驟4： 由于pH值取決于溫度，所有溶液的pH值都應(yīng)在25°C時測量。
操作步驟
1. 取5克（精確至0.1克）目標(biāo)肌肉組織樣本，確保不含可見脂肪或結(jié)締組織，隨后切成小塊。
2. 取小燒杯，將肌肉組織浸入20毫升冰浴PBS（磷酸鹽緩沖液）中，其中添加了10 mM EDTA。
3. 用剪刀把肌肉切成小塊。
4. 用含10 mM EDTA的冰凍PBS緩沖液對碎肌肉進行2-3次清洗。
5. 將切碎的肌肉重新懸浮于5毫升冰凍的含10 mM EDTA的PBS溶液中。
6. 以200 × g 離心5分鐘，棄去上清液。
重要提示： 組織與分離緩沖液的最佳比例范圍為1：5 至1：10（w/v）。
8. 使用 以1 600 rpm 轉(zhuǎn)速運行的Teflon杵的Potter-Elvehjem研磨器均質(zhì)化肌肉組織； 將均質(zhì)化的肌肉搗碎10至20次 。
重要提示： 在開始實驗前5分鐘將玻璃器皿置于冰浴中預(yù)冷。勻漿及后續(xù)步驟必須在4 ℃下進行,以盡量減少磷脂酶和蛋白酶的激活，從而避免對肌肉造成損傷。
9. 將勻漿液轉(zhuǎn)移至50 mL聚丙烯Falcon管中， 在4℃下以700× g 離心 10分鐘 。
10. 將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中， 4℃ 以8000× g 離心10分鐘。
14. 使用Biuret/Bradford法中的一種方法測定線粒體濃度Bicinchoninic Acid assay（BCA）法。
參考文獻
Bhattacharya，S. K.，J. H. Thakar，P. L. Johnson和D. R. Shanklin. 1991.使用含有EDTA和Nagarse的離子介質(zhì)從
倉鼠中分離骨骼肌線粒體。分析生物化學(xué)192： 344 — 349 。
Frezza，C.，S. Cipolat，and L. Scorrano. 2007 .小鼠肝臟、肌肉 和培養(yǎng)成纖維細胞中線粒體的分離與功能。
Nat. Protoc. 2： 287 —295。
Mohan，A.，M. C. Hunt，S. Muthukrishnan，T. A. Houser和T. E. Barstow. 2010c. 分區(qū)乳酸和蘋果酸脫氫酶對
肌紅蛋白氧化還原形式穩(wěn)定性的研究。農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志58： 7021 — 7029 。
i. 完整肌肉或絞肉的耗氧量
原則
新鮮切割的肉片需經(jīng)過標(biāo)準化的氧氣處理（即讓其充分氧化），隨后進行真空包裝。通過酶呼吸作用導(dǎo)致的氧化肌肉組織（OMb）減少量，可作為 衡量組織 氧氣消耗能力 的 指標(biāo) 。 在25℃水浴或培養(yǎng)箱中 ， 立即記錄400-700納米波長范圍內(nèi)的反射光譜 ，并在20分鐘后再次測量。 氧化肌紅蛋白水平通過 K / S 轉(zhuǎn)換公式計算得出，具體方法詳見第九節(jié)。 K / S 610/ K / S 525比值越高，表明OMb含量越高。氧氣消耗量（OC）以 首次與末次測量的百分比差異 形式呈現(xiàn)。
設(shè)備和用品
1. 真空包裝機
2. 聚氯乙烯薄膜
4. 能掃描并記錄400至700 nm表面反射率的分光光度計（見 第IX節(jié)）
操作步驟
1. 例如，所有待測樣品必須處于相同溫度（4 ° C）下，否則溫度越高，樣本的耗氧量越快，而藻華發(fā)育（即富氧）則越慢；溫度越低，耗氧量越慢，藻華發(fā)育則越快。
2. 為確保氧氣供應(yīng)均勻，所有樣本需保存在 2-4℃ 的環(huán)境中。對于完整 肌肉樣本 ，應(yīng)用鋒利刀具切取3厘米×3厘米×2厘米的樣本塊 ，盡量去除可見脂肪和結(jié)締組織。研磨樣本則需準備體積相當(dāng)?shù)木鶆驂簩嵙⒎襟w，其可見脂肪含量應(yīng)與樣本瘦肉部分的典型水平相當(dāng)。切記使用鈍刀具，以免破壞表面結(jié)構(gòu)。同時避免對研磨樣本的表面進行過度操作或擠壓（參見Madhavi和 Carpenter ， 1993 年研究）。
3. 如果表面不是新鮮的切割面，那么在開始開花步驟之前， 只需去除一層薄薄的表面層，以暴露新鮮的組織 。
4. 用一小塊透氣膜覆蓋新切面，防止干燥。將聚氯乙烯膜（常用）平鋪一層，確保表面均勻接觸空氣。記錄膜的透氣性。
5. 在2至4 °C（或其他標(biāo)準時間）下進行2小時的顯色。注意使所有樣品在該步驟中保持相同的溫度，因為顯色非常依賴于溫度。
6. 花開后 ， 去除聚氯乙烯薄膜并將樣品放入氧氣滲透性極低的袋中 。用高真空快速真空包裝；保持樣品間的真空均勻。
7. 立即掃描樣品表面，以 測定400至700nm范圍內(nèi)的反射率 ，從而 確定初始OMb 。 光譜儀必須通過 真空袋薄膜進行校準。
8. 為加快氧氣消耗，使用25 ° C的培養(yǎng)箱或水浴。20分鐘后（或根據(jù)所用肉類的適當(dāng)標(biāo)準時間）重新掃描同一表面。
計算
%OMb =[ K/S 610÷ K/S 525（100%DMb）]-[ K/S 610÷ K/S 525（樣品）]÷[ K/S 610÷ K/S 525（100%
DMb）]-[ K/S 610÷ K/S 525（100% OMb）][ ×100 ]。
氧消耗量 = [（初始OMb%−最終OMb%）÷初始OMb%]×100。
記下
馬達維和卡彭特（1993年）提出了一種利用反射光譜儀測量氧氣消耗量（OC）的檢測方法。該方法通過配備反射光譜附件的分光光度計， 首先對真空包裝樣品的表面有機物（OMb）含量 進行測定， 并以5分鐘 為間隔（總計20分鐘）在4℃ 條件下重復(fù)測量。 樣品尺寸經(jīng)過調(diào)整（2.5×2.5×0.5厘米）以適應(yīng)反射光譜儀的樣品接口。有機物的相對濃度采用克日維茨基（1979年）的方法計算，但唐等人（2004年）對其進行了改進，并推薦了 修訂后的波長參數(shù)（詳見第九節(jié)）。 氧氣消耗量以百分比形式表示 ，即 真空包裝樣品在10分鐘內(nèi)消耗的初始表面有機物量 。
Mancini、Hunt和Kropf（2003）報告了一種使用610nm反射率直接測定OMb 的方法。這是可能的，因為OMb在610nm處具有其獨特的反射率，而610nm 對DMb和MMb都是等滲的（關(guān)于肉表面反射率測量和 K/S 比率 的進一步討論，參見第IX節(jié)）。 該方法已成功使用（參見King等人 ， 2011）。
部分研究采用單位時間內(nèi)有機物（OMb）百分比變化值來報告實際“耗氧量”，但這種方法操作繁瑣且耗時。對于大量樣本，通常將“耗氧量”計算為樣本初始有機物含量的“平均百分比降幅”。 樣本脫氧時間需標(biāo)準化 ， 通常 20分鐘即可檢測出樣本差異 。
參考文獻
King，D. A.，S. D. Shackelford，A. B. Rodriguez和T. L. Wheeler. 2011.測量時間對肌紅蛋白還原活性和耗氧量
與長肌肉色穩(wěn)定性儀器測量值之間關(guān)系的影響。Meat Sci. 87 ：26— 32 。
Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影響牛肉肌肉的顏色、高鐵肌紅蛋白還原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 —942。
曼奇尼 ，R . A .，M . C . 亨特 ，和D . H . 克羅普 .2003. 610納米反射率估計牛肉表面的氧合血紅蛋白含量 . Meat Sci . 64 ：157— 162 .
Mohan，A.，M. C. Hunt，T. J. Barstow，T. A. Houser和D. M. Hueber. 2010a. 通過近紅外血氧測定法檢測三種后強直期骨骼肌中肌紅蛋白的氧化還原形態(tài)。Food Chem. 123 ：456—464。
唐，J.，C.福斯特曼，和T. A.霍格蘭。2004年。重新審視克日維茨基，水性肉類提取物中肌紅蛋白氧化還原形式分光光度測定的方程式。食品科學(xué)雜志69： C717 — C720 。
J.完整肉或碎肉的肌紅蛋白還原能力
原則
首先將樣本切片浸入稀硝酸鈉溶液中浸泡20分鐘，使表面色素氧化生成甲基甲基藍（MMb） 。隨后將切片（厚度1.27厘米）真空包裝，在30℃環(huán)境下通過測量 K/S 比值 （572/525納米波長）持續(xù)監(jiān)測表面MMb含量2小時。樣品的還原能力定義為培養(yǎng)期間 表面MMb濃度的百分比降幅。MMb濃度的下降程度可視為組織還原鐵血紅素鐵 能力的反映。
試劑
1. 0.3%（w/w）亞硝酸鈉溶液：稱取大燒杯，稱取 3.0 g NaNO 2 加入燒杯中，加蒸餾水至1000克，每日新鮮配制，室溫孵育。
操作步驟
1. 取一塊3cm×3cm×2cm的肌肉組織樣本（無可見脂肪或結(jié)締組織），若使用絞肉則取一塊大小相近且緊密壓實的樣本，以防止樣本浸入時碎裂。
2. 務(wù)必先對樣本進行定位，以便確定后續(xù)要評估的表面。該表面可能是新切面，也可能是展示過的表面。
3. 將樣品浸入0.3% NaNO 在0.3% NaNO 溶液中室溫浸泡20分鐘以誘導(dǎo)MMb形成。研磨后的樣品可置于小篩網(wǎng)上，以幫助降低和提升立方體，同時盡量減少碎裂。
4. 從燒杯中取出樣品，用布擦去多余的溶液。 盡可能保留三維形狀，并將用于評價的表面放入 不透水的袋中并真空包裝（真空度均勻）。真空可能會 稍微壓平或圓化樣品 。
5. 立即掃描400至700 nm的反射率，以確定 表面形成的MMb的初始量 。 保持表面完整性 。
6. 將樣品置于30°C的培養(yǎng)箱中 ，2小時后重新掃描以測定MMb的剩余量。
計算
%MMb =[ K/S 572÷ K/S 525（100%DMb）]-[ K/S 572÷ K/S 525（樣品）]÷[ K/S 572÷ K/S 525
（100%DMb）]-[ K/S 572÷ K/S 525（100% MMb）][ ×100 ]。
MRA（MMb減少的百分比） =[（初始%MMb−最終%MMb）÷初始%MMb]×100 或?qū)⒊跏糓Mb作為 MRA 的指標(biāo)（見下文注釋）。
記下
部分研究者（McKenna等，2005；Mancini等，2008）指出，亞硝酸鈉溶液中氧化反應(yīng)生成的MMb初始量可作為樣本 MRA 的良好指標(biāo)。但King等（2011）發(fā)現(xiàn)，MMb的還原百分比比其初始生成量更具參考價值。因此，建議同時采集并統(tǒng)計分析MMb的初始生成量及其在孵育過程中的還原百分比。
參考文獻
King，D. A.，S. D. Shackelford，A. B. Rodriguez和T. L. Wheeler. 2011.測量時間對肌紅蛋白還原活性和耗氧量
與長肌肉色穩(wěn)定性儀器測量值之間關(guān)系的影響。Meat Sci. 87 ：26— 32 。曼奇尼，R.A.、M.塞弗特和M.C.亨特。2008年。數(shù)據(jù)表達、樣本位置和氧分壓對牛肉肌肉中一氧化氮高鐵肌紅蛋白形成和高鐵肌紅蛋白還原活性測量的影響。肉類科學(xué) 79 ：244—251。
McKenna，D. R.，P. D. Mies，B. E. Baird，K. D. Pfeiffer，J. W. Ellebracht，and J. W. Savell. 2005.影響19種牛肌肉變色特征的生化和物理因素。Meat Sci. 70 ：665—682。
Mohan，A.，S. Muthukrishnan，M. C. Hunt，T. J. Barstow，and T. A. Houser. 2010d.蘋果酸脫氫酶還原高鐵肌紅蛋白的動力學(xué)。農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志58：6994— 7000 。
雷恩斯，C.R.、M.C.亨特和J.A.昂魯，2010年。不同顏色穩(wěn)定性的肌肉對牛肉整體顏色穩(wěn)定性的貢獻。食品科學(xué)雜志 75 ：C85-C89。
Sammel，L. M.，M. C. Hunt，D. H. Kropf，K. A. Hachmeister，C. L. Kastner，and D. E. Johnson. 2002b. 肉牛半膜肌內(nèi)外化學(xué)特性對顏色性狀的影響 . J. Food Sci. 67 ： 1323 — 1330 .
瓦茨、B. M.、J. 克倫德、M. W. 希普瑟、B. 哈欽斯和B. 薩利赫。1966年。肉類中的酶還原途徑。J. 食品科學(xué) 32 ：855-862。
原則：
純化肌紅蛋白有時是必要的，例如用于比較 不同物種 肌紅蛋白（Mb）的自氧化速率。 肌紅蛋白（分子量 約 16,949）可以從骨骼肌或心肌中輕松純化 。其紅色便于在層析過程中直觀觀察。該方法使用相對廉價的設(shè)備即可獲得較高產(chǎn)率的肌紅蛋白（Faustman和Phillips，2001；改編自Wittenberg和Wittenberg，1981年以及Trout和Gutzke，1996年的早期方法）。
樣品、試劑和溶液
1. 去脂去筋的牛肉塊
2. 均質(zhì)化緩沖液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C
3. 氫氧化鈉
4. 硫酸銨
5. 透析緩沖液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C
6. 色譜洗脫緩沖液（5 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.5）在4 °C
記下
為了將亞鐵肌紅蛋白的形成降至最低，均質(zhì)化和所有后續(xù)步驟應(yīng)在0至5 ° C和高pH（8.0至8.5）下進行。
設(shè)備
攪拌器、紗布、 4℃ 下 20,000×g 轉(zhuǎn)速離心機、透析管（分子量截留值12 ，000至14 ，000）、 Sephracryl S - 200HR色譜柱（30× 2.5至cm）、蠕動泵。需要額外試劑和設(shè)備來測定蛋白質(zhì)濃度，或 基于其消光系數(shù)計算肌紅蛋白濃度 。
制備勻漿
1. 將150克切碎的肌肉與450毫升勻漿緩沖液放入攪拌機中進行勻漿處理高速運轉(zhuǎn)1至2分鐘。
2. 將勻漿液均等分裝至各試管中， 在4℃ 下以3000× g 離心10分鐘。
3. 棄去池上清液， 用氫氧化鈉 調(diào)節(jié)所得上清液的pH至8.0。
4. 用兩層紗布過濾上清液，以去除脂質(zhì)和結(jié)締組織顆粒。
沉淀肌紅蛋白
1. 將濾液飽和至70%硫酸銨濃度（472克硫酸銨/升濾液），用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0，
攪拌1小時。
2. 將勻漿液均等分裝至各試管中，4℃條件下以18,000× g 離心20分鐘，去除沉淀蛋白。
3. 合并上清液，棄去沉淀。
4. 將上清液從70%濃度調(diào)整至100%硫酸銨飽和度（通過添加（上清液中額外添加228克硫酸銨/L），用 氫氧化鈉 調(diào)節(jié)pH至8.0， 并攪拌1小時 。
5. 將勻漿液均分至各試管中，隨后以1000×g離心1小時。20,000 × g ，4 ° C。棄去上清液，加入1或2 mL冰冷卻緩沖液以幫助沉淀物的回收。
透析和純化肌紅蛋白
1. 將沉淀的肌紅蛋白轉(zhuǎn)移至透析管中，并在4 ° C下使用透析緩沖液（1體積蛋白質(zhì)，10體積緩沖液）透析24小時，每8小時更換緩沖液。
2. 使用蠕動泵 ，用色譜洗脫 緩沖液（3個色譜柱體積）平衡Sephacryl S-200 HR色譜柱。
3. 將透析液加入色譜柱，以60mL/小時的流速用色譜洗脫緩沖液洗脫肌紅蛋白提取物。該步驟將血紅蛋白與肌紅蛋白分離。血紅蛋白將首先洗脫為淡紅色/棕色條帶。肌紅蛋白隨后作為 明顯可見的深紅色條帶洗脫。
4. 使用分餾收集器收集含肌紅蛋白的餾分。
肌紅蛋白濃縮物
1. 將所有含肌紅蛋白的組分進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用天然聚丙烯酰胺凝膠電泳法可評估肌紅蛋白提取物的純度， 該提取物應(yīng)產(chǎn)生一條分子量為17kDa的單一蛋白條帶 。
2. 使用離心濃縮器濃縮肌紅蛋白溶液。
3. 或者（步驟2的替代方案），將肌紅蛋白溶液飽和至100%硫酸銨濃度（761克硫酸銨/升溶液），將pH調(diào)節(jié)至8.0，攪拌溶液1 小時 。 將溶液均分至各試管中，并在4°C下以20,000×g離心1小時 ， 000×g g 。 排棄上清液，并按前述方法透析肌紅蛋白 。
4. 或者（步驟2和3），肌紅蛋白可通過 Trout和Gutzke（1996）所述 的超濾法濃縮。
5. 測定肌紅蛋白溶液的蛋白質(zhì)濃度，并分裝至 -80℃ 冷凍保存。
記下
這種肌紅蛋白分離程序的產(chǎn)量相對較低，需要2到3個月的 收集才能得到大量的 肌紅蛋白。
參考文獻
Faustman，C.和A. Phillips. 2001.新鮮肉變色的測量. 《食品分析化學(xué)最新協(xié)議》 第F3.3單元，S.J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.，紐約。
特勞特，G.R.和D.A.古茲克。1996年。一種簡單、快速的制備方法，用于分離和純化氧肌紅蛋白。肉類科學(xué)43 ：1- 13 。
Wittenberg，J. B.和B. A. Wittenberg. 1981.肌紅蛋白的制備. Methods Enzymol. 76 ：29–42.
H.從牛骨骼肌中分離線粒體
原則
線粒體分離包含三個步驟：細胞裂解、勻漿和離心。使用蛋白酶處理骨骼肌可顯著促進線粒體釋放，同時提高產(chǎn)量。
試劑
1. 1 M蔗糖：將342.3 g蔗糖溶于1 L蒸餾水中，混勻，分裝成20 mL等分試樣， 于-20℃ 保存。
2. 0.1 M Tris/MOPS：將12.1克Tris[三（羥甲基）氨基甲烷]溶解于500 mL 蒸餾水中 ， 調(diào)節(jié)pH 至7 。 使用MOPS [ 3 -（N -嗎啉代）丙磺酸]粉末，將溶液定容至1 L，并于4 ° C保存。
3. 1 M Tris/鹽酸：將121.14 g Tris溶于500 mL蒸餾水中， 用鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7.4 ， 將溶液稀釋至1 L并室溫保存 。
4. 1 M EDTA：將372.2 g EDTA（乙二胺四乙酸）溶于500 mL 蒸餾水中，并于4℃保存 。
5. 10% BSA：將10 g BSA（牛血清白蛋白）溶于100 mL蒸餾水中， 存放于-20℃ 。
7. 10mMEDTA：將2.92gEDTA溶于1L蒸餾水中，并于4℃ 保存 。
8. 0.5%BSA：將5 g BSA溶于1 L蒸餾水中，并于-20 °C 下保存。
9. 納加酶：配制20毫克/100毫升分離液濃度的納加酶溶液（即20毫克/100毫升）。
重要提示： 其他蛋白酶（胰蛋白酶）的選擇取決于研究者偏好和方案，以及用于分離線粒體
的肌肉類型。
關(guān)鍵步驟3： 實驗當(dāng)天制備所有緩沖液，以避免儲存的緩沖液中細菌/酵母生長。
關(guān)鍵步驟4： 由于pH值取決于溫度，所有溶液的pH值都應(yīng)在25°C時測量。
操作步驟
1. 取5克（精確至0.1克）目標(biāo)肌肉組織樣本，確保不含可見脂肪或結(jié)締組織，隨后切成小塊。
2. 取小燒杯，將肌肉組織浸入20毫升冰浴PBS（磷酸鹽緩沖液）中，其中添加了10 mM EDTA。
3. 用剪刀把肌肉切成小塊。
4. 用含10 mM EDTA的冰凍PBS緩沖液對碎肌肉進行2-3次清洗。
5. 將切碎的肌肉重新懸浮于5毫升冰凍的含10 mM EDTA的PBS溶液中。
6. 以200 × g 離心5分鐘，棄去上清液。
重要提示： 組織與分離緩沖液的最佳比例范圍為1：5 至1：10（w/v）。
8. 使用 以1 600 rpm 轉(zhuǎn)速運行的Teflon杵的Potter-Elvehjem研磨器均質(zhì)化肌肉組織； 將均質(zhì)化的肌肉搗碎10至20次 。
重要提示： 在開始實驗前5分鐘將玻璃器皿置于冰浴中預(yù)冷。勻漿及后續(xù)步驟必須在4 ℃下進行,以盡量減少磷脂酶和蛋白酶的激活，從而避免對肌肉造成損傷。
9. 將勻漿液轉(zhuǎn)移至50 mL聚丙烯Falcon管中， 在4℃下以700× g 離心 10分鐘 。
10. 將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中， 4℃ 以8000× g 離心10分鐘。
14. 使用Biuret/Bradford法中的一種方法測定線粒體濃度Bicinchoninic Acid assay（BCA）法。
參考文獻
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i. 完整肌肉或絞肉的耗氧量
原則
新鮮切割的肉片需經(jīng)過標(biāo)準化的氧氣處理（即讓其充分氧化），隨后進行真空包裝。通過酶呼吸作用導(dǎo)致的氧化肌肉組織（OMb）減少量，可作為 衡量組織 氧氣消耗能力 的 指標(biāo) 。 在25℃水浴或培養(yǎng)箱中 ， 立即記錄400-700納米波長范圍內(nèi)的反射光譜 ，并在20分鐘后再次測量。 氧化肌紅蛋白水平通過 K / S 轉(zhuǎn)換公式計算得出，具體方法詳見第九節(jié)。 K / S 610/ K / S 525比值越高，表明OMb含量越高。氧氣消耗量（OC）以 首次與末次測量的百分比差異 形式呈現(xiàn)。
設(shè)備和用品
1. 真空包裝機
2. 聚氯乙烯薄膜
4. 能掃描并記錄400至700 nm表面反射率的分光光度計（見 第IX節(jié)）
操作步驟
1. 例如，所有待測樣品必須處于相同溫度（4 ° C）下，否則溫度越高，樣本的耗氧量越快，而藻華發(fā)育（即富氧）則越慢；溫度越低，耗氧量越慢，藻華發(fā)育則越快。
2. 為確保氧氣供應(yīng)均勻，所有樣本需保存在 2-4℃ 的環(huán)境中。對于完整 肌肉樣本 ，應(yīng)用鋒利刀具切取3厘米×3厘米×2厘米的樣本塊 ，盡量去除可見脂肪和結(jié)締組織。研磨樣本則需準備體積相當(dāng)?shù)木鶆驂簩嵙⒎襟w，其可見脂肪含量應(yīng)與樣本瘦肉部分的典型水平相當(dāng)。切記使用鈍刀具，以免破壞表面結(jié)構(gòu)。同時避免對研磨樣本的表面進行過度操作或擠壓（參見Madhavi和 Carpenter ， 1993 年研究）。
3. 如果表面不是新鮮的切割面，那么在開始開花步驟之前， 只需去除一層薄薄的表面層，以暴露新鮮的組織 。
4. 用一小塊透氣膜覆蓋新切面，防止干燥。將聚氯乙烯膜（常用）平鋪一層，確保表面均勻接觸空氣。記錄膜的透氣性。
5. 在2至4 °C（或其他標(biāo)準時間）下進行2小時的顯色。注意使所有樣品在該步驟中保持相同的溫度，因為顯色非常依賴于溫度。
6. 花開后 ， 去除聚氯乙烯薄膜并將樣品放入氧氣滲透性極低的袋中 。用高真空快速真空包裝；保持樣品間的真空均勻。
7. 立即掃描樣品表面，以 測定400至700nm范圍內(nèi)的反射率 ，從而 確定初始OMb 。 光譜儀必須通過 真空袋薄膜進行校準。
8. 為加快氧氣消耗，使用25 ° C的培養(yǎng)箱或水浴。20分鐘后（或根據(jù)所用肉類的適當(dāng)標(biāo)準時間）重新掃描同一表面。
計算
%OMb =[ K/S 610÷ K/S 525（100%DMb）]-[ K/S 610÷ K/S 525（樣品）]÷[ K/S 610÷ K/S 525（100%
DMb）]-[ K/S 610÷ K/S 525（100% OMb）][ ×100 ]。
氧消耗量 = [（初始OMb%−最終OMb%）÷初始OMb%]×100。
記下
馬達維和卡彭特（1993年）提出了一種利用反射光譜儀測量氧氣消耗量（OC）的檢測方法。該方法通過配備反射光譜附件的分光光度計， 首先對真空包裝樣品的表面有機物（OMb）含量 進行測定， 并以5分鐘 為間隔（總計20分鐘）在4℃ 條件下重復(fù)測量。 樣品尺寸經(jīng)過調(diào)整（2.5×2.5×0.5厘米）以適應(yīng)反射光譜儀的樣品接口。有機物的相對濃度采用克日維茨基（1979年）的方法計算，但唐等人（2004年）對其進行了改進，并推薦了 修訂后的波長參數(shù)（詳見第九節(jié)）。 氧氣消耗量以百分比形式表示 ，即 真空包裝樣品在10分鐘內(nèi)消耗的初始表面有機物量 。
Mancini、Hunt和Kropf（2003）報告了一種使用610nm反射率直接測定OMb 的方法。這是可能的，因為OMb在610nm處具有其獨特的反射率，而610nm 對DMb和MMb都是等滲的（關(guān)于肉表面反射率測量和 K/S 比率 的進一步討論，參見第IX節(jié)）。 該方法已成功使用（參見King等人 ， 2011）。
部分研究采用單位時間內(nèi)有機物（OMb）百分比變化值來報告實際“耗氧量”，但這種方法操作繁瑣且耗時。對于大量樣本，通常將“耗氧量”計算為樣本初始有機物含量的“平均百分比降幅”。 樣本脫氧時間需標(biāo)準化 ， 通常 20分鐘即可檢測出樣本差異 。
參考文獻
King，D. A.，S. D. Shackelford，A. B. Rodriguez和T. L. Wheeler. 2011.測量時間對肌紅蛋白還原活性和耗氧量
與長肌肉色穩(wěn)定性儀器測量值之間關(guān)系的影響。Meat Sci. 87 ：26— 32 。
Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影響牛肉肌肉的顏色、高鐵肌紅蛋白還原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 —942。
曼奇尼 ，R . A .，M . C . 亨特 ，和D . H . 克羅普 .2003. 610納米反射率估計牛肉表面的氧合血紅蛋白含量 . Meat Sci . 64 ：157— 162 .
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唐，J.，C.福斯特曼，和T. A.霍格蘭。2004年。重新審視克日維茨基，水性肉類提取物中肌紅蛋白氧化還原形式分光光度測定的方程式。食品科學(xué)雜志69： C717 — C720 。
J.完整肉或碎肉的肌紅蛋白還原能力
原則
首先將樣本切片浸入稀硝酸鈉溶液中浸泡20分鐘，使表面色素氧化生成甲基甲基藍（MMb） 。隨后將切片（厚度1.27厘米）真空包裝，在30℃環(huán)境下通過測量 K/S 比值 （572/525納米波長）持續(xù)監(jiān)測表面MMb含量2小時。樣品的還原能力定義為培養(yǎng)期間 表面MMb濃度的百分比降幅。MMb濃度的下降程度可視為組織還原鐵血紅素鐵 能力的反映。
試劑
1. 0.3%（w/w）亞硝酸鈉溶液：稱取大燒杯，稱取 3.0 g NaNO 2 加入燒杯中，加蒸餾水至1000克，每日新鮮配制，室溫孵育。
操作步驟
1. 取一塊3cm×3cm×2cm的肌肉組織樣本（無可見脂肪或結(jié)締組織），若使用絞肉則取一塊大小相近且緊密壓實的樣本，以防止樣本浸入時碎裂。
2. 務(wù)必先對樣本進行定位，以便確定后續(xù)要評估的表面。該表面可能是新切面，也可能是展示過的表面。
3. 將樣品浸入0.3% NaNO 在0.3% NaNO 溶液中室溫浸泡20分鐘以誘導(dǎo)MMb形成。研磨后的樣品可置于小篩網(wǎng)上，以幫助降低和提升立方體，同時盡量減少碎裂。
4. 從燒杯中取出樣品，用布擦去多余的溶液。 盡可能保留三維形狀，并將用于評價的表面放入 不透水的袋中并真空包裝（真空度均勻）。真空可能會 稍微壓平或圓化樣品 。
5. 立即掃描400至700 nm的反射率，以確定 表面形成的MMb的初始量 。 保持表面完整性 。
6. 將樣品置于30°C的培養(yǎng)箱中 ，2小時后重新掃描以測定MMb的剩余量。
計算
%MMb =[ K/S 572÷ K/S 525（100%DMb）]-[ K/S 572÷ K/S 525（樣品）]÷[ K/S 572÷ K/S 525
（100%DMb）]-[ K/S 572÷ K/S 525（100% MMb）][ ×100 ]。
MRA（MMb減少的百分比） =[（初始%MMb−最終%MMb）÷初始%MMb]×100 或?qū)⒊跏糓Mb作為 MRA 的指標(biāo)（見下文注釋）。
記下
部分研究者（McKenna等，2005；Mancini等，2008）指出，亞硝酸鈉溶液中氧化反應(yīng)生成的MMb初始量可作為樣本 MRA 的良好指標(biāo)。但King等（2011）發(fā)現(xiàn)，MMb的還原百分比比其初始生成量更具參考價值。因此，建議同時采集并統(tǒng)計分析MMb的初始生成量及其在孵育過程中的還原百分比。
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