近年來隨著基因治療持續(xù)發(fā)展，使得業(yè)界對慢病毒載體（Lentiviral vectors，LVs）規(guī)模化、低成本的純化工藝產(chǎn)生了濃厚興趣。目前，實驗室規(guī)模普遍采用超速離心法對慢病毒進行純化。雖然可獲得高濃度慢病毒，但存在明顯局限性比如穩(wěn)定性差，長時間處理會導(dǎo)致部分載體失活；殘留雜質(zhì)可能引發(fā)非預(yù)期效應(yīng)或降低療效；回收率低且難以放大等。

慢病毒是一種直徑80-120 nm的對稱球形包膜病毒，由包膜蛋白、包膜、基質(zhì)蛋白、衣殼、兩條單鏈RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶組成。在基因治療領(lǐng)域，慢病毒因其高效轉(zhuǎn)導(dǎo)和長期表達的特性成為遞送基因的“明星工具”。

慢病毒下游純化工藝三大難點

1.病毒脆弱，活性難保
慢病毒像“嬌貴的泡泡”，純化過程中容易因剪切力、壓力變化、溶液pH和鹽濃度波動導(dǎo)致失活。
慢病毒穩(wěn)定性差，初期研究發(fā)現(xiàn)，澄清后的慢病毒樣品在室溫靜置保存2小時后活性滴度會下降約20%。

2.雜質(zhì)難除，安全存憂
慢病毒在收獲時，細胞活率較低，慢病毒培養(yǎng)上清中混雜著宿主細胞分泌的蛋白質(zhì)（HCP）和DNA（HCD），傳統(tǒng)方法難以徹底清除。
慢病毒與游離DNA通過電荷相互作用^[5]、空間位阻效應(yīng)^[6]可以形成大顆粒復(fù)合物，進一步影響雜質(zhì)的去除。

3.下游純化，收率低
慢病毒收獲液濁度較高，濾膜容易堵塞，澄清時回收率低。
經(jīng)電鏡實測慢病毒的直徑在80-120 nm之間，且容易形成＞200 nm的大顆粒，導(dǎo)致在除菌過濾時回收率較低。


Cytiva Fast Trak破解之道

1. 突破穩(wěn)定性瓶頸
溫和且快速的純化工藝：Hollow Fiber因為條件溫和，剪切力低，對于自身穩(wěn)定性差的慢病毒較為友好，所以選用Hollow Fiber對慢病毒進行濃縮/換液。Cytiva的Capto Core 700層析為流穿模式，在保證雜質(zhì)去除能力的前提下工藝時間更短，Capto Core 700層析回收率可以達到90%。
選擇適合的緩沖液：不要使用高鹽或極端pH緩沖液可以有效避免病毒顆粒解體。另外可以添加蔗糖或者葡萄糖等作為保護劑，保護病毒結(jié)構(gòu)。

2. 增強雜質(zhì)去除力
酶切條件優(yōu)化：在慢病毒純化工藝中使用核酸酶對收獲液進行酶處理以降解各種形式的DNA和RNA，從而達到去除樣品中核酸的目的。同時考慮到工藝經(jīng)濟性的問題，對全能核酸酶的酶切濃度、溫度和時長進行了優(yōu)化。優(yōu)化后酶處理工藝可以降解99%以上的HCD。
復(fù)合模式層析：Cytiva的Capto Core 700為復(fù)合模式層析填料，表層是具有一定孔徑的鈍化層，慢病毒等大于700 kDa的大分子可以經(jīng)過外水直接流穿。較小的分子如RNA片段、HCP和內(nèi)毒素片段等經(jīng)過小孔進入內(nèi)核，與微球內(nèi)的配基吸附結(jié)合，可以實現(xiàn)慢病毒和雜質(zhì)的分離。


3.提高病毒回收率
澄清工藝：采用Hollow Fiber進行澄清具有低剪切力的優(yōu)勢，選用0.65 μm的中空纖維柱進行澄清。在澄清工藝中特別是對透過通量進行了研究，從圖4中可以看到透過通量保持穩(wěn)定，工藝過程中跨膜壓也較低。經(jīng)優(yōu)化，澄清步驟回收率顯著提高。
除菌過濾：為提高慢病毒除菌過濾工藝的回收率，一方面可進行濾器篩選，另一方面對濾器載量和過濾速度進行優(yōu)化。優(yōu)化后除菌過濾的慢病毒回收率可達到80%，大大提高了下游純化工藝的整體回收率。
層析填料介紹


Cytiva（思拓凡）——Capto Core 700 多模式層析填料
產(chǎn)品詳情
Capto™ 填料基于堅硬的高流動性瓊脂糖基架，具有優(yōu)化的孔隙結(jié)構(gòu)，可提供良好的壓力和流動性。這種填料旨在用于工藝開發(fā)和大規(guī)模制造，但也用于研究實驗室。它們的高流速可提高生產(chǎn)率和大批量加工能力。
Capto Core系列填料為雙層設(shè)計，表層是具有一定孔徑的鈍化層，它可以排阻大分子，使之流穿。小分子通過表層進入填料內(nèi)部核心，核心層可以結(jié)合雜質(zhì)分子。這一設(shè)計使得該系列填料具有分子排阻和吸附層析的雙重特點。該系列填料的優(yōu)點包括高載量、高流速、短保留時間、在寬操作窗口內(nèi)保持強大性能、工藝設(shè)計簡單和生產(chǎn)效率高。
新型核心層析技術(shù)和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能。具有分子排阻和結(jié)合特性。
產(chǎn)品優(yōu)點：
· 新型核心層析技術(shù)和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能，具有分子排阻和結(jié)合特性。
· 新型核心層析技術(shù)可高效捕獲污染物，同時在流穿過程中收集靶分子。
· 與標準分子排阻（凝膠過濾）方法相比，顯著提高了生產(chǎn)率并提高了流速。
· 通過流穿層析法和穩(wěn)定的性能進行直接優(yōu)化。
· 使用預(yù)填充 HiTrap 和 HiScreen 層析柱進行便捷的小規(guī)模純化、工藝開發(fā)和規(guī)模擴大。
· 填料可滿足供應(yīng)安全、性能穩(wěn)定和監(jiān)管支持方面的工業(yè)需要。
污染物的多模式去除：
Capto Core 700 多模式層析填料由配基活化核心和惰性外殼組成。惰性外殼不允許大分子（臨界值約為 Mr 700000）通過外殼的孔進入核內(nèi)。在層析柱流穿過程中收集這些較大分子，而較小雜質(zhì)與內(nèi)化配基結(jié)合。
疏水性、帶正電荷的配基：
Capto Core 700多模式層析填料內(nèi)核配基具有疏水性同時帶正電荷，從而可對小至足以進入核心的各種污染物進行高效多模式結(jié)合。多模式配基可確保在較寬的 pH 值和鹽濃度范圍內(nèi)與大多數(shù)雜質(zhì)強結(jié)合。通過使用 NaOH 和可在大多數(shù)情況下使用的溶劑進行的原位清潔 (CIP) 程序，從填料中去除結(jié)合的雜質(zhì)。
規(guī)模放大較為簡單：
HiTrap 和 HiScreen 層析柱可串聯(lián)連接以增加載量，并且在開發(fā)高效且可靠的分離方法時可方便使用。

在基因治療產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵賽道上，慢病毒載體的高效純化是決定技術(shù)轉(zhuǎn)化與臨床應(yīng)用的核心環(huán)節(jié)，而“高親和性”與“廣譜適應(yīng)性”則是層析填料破解純化難題的核心訴求。傳統(tǒng)純化工藝面臨的病毒失活、雜質(zhì)殘留、收率不足等痛點，本質(zhì)上呼喚著兼具精準靶向、穩(wěn)定兼容與規(guī)�；瘽摿Φ奶盍辖鉀Q方案。

Cytiva（思拓凡）推出的Capto Core 700多模式層析填料，正是這一需求的理想應(yīng)答者。其基于雙層結(jié)構(gòu)設(shè)計與辛胺配基的創(chuàng)新組合，既憑借疏水性與正電荷的多模式結(jié)合特性，實現(xiàn)了對HCP、HCD、內(nèi)毒素等各類雜質(zhì)的高親和捕獲，又以700 kDa的分子排阻臨界值，為慢病毒等大分子載體提供了廣譜適配的流穿分離路徑，完美契合“高親和、廣適應(yīng)”的核心要求。同時，溫和的工藝條件保障了病毒活性，優(yōu)化后的澄清、除菌過濾流程與填料的高流速、高載量優(yōu)勢，共同實現(xiàn)了回收率與生產(chǎn)效率的雙重提升，更兼顧了從實驗室研發(fā)到工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)的無縫銜接。