文獻解讀：上樣量對咖啡因和睪酮軟膏體外透皮試驗的經(jīng)皮吸收數(shù)據(jù)影響
實驗研究 | 上樣量多少對咖啡因和睪酮軟膏體外透皮試驗的經(jīng)皮吸收數(shù)據(jù)影響
引言：
韓國檀國大學Jueng-Eun Im、Kyu-Bong Kim團隊聯(lián)合韓國食品藥品安全評估院等機構，在《Pharmaceutics》（2021年，Vol.13, IF=6.525）發(fā)表研究，通過Biox AquaFlux™ AF200和Hanson Franz擴散池系統(tǒng)，明確了應用量對咖啡因、睪酮體外皮膚吸收的影響，提出了風險評估所需的最優(yōu)應用劑量。
摘要：
化學品的皮膚吸收是風險評估的重要因素。本研究探討了不同應用量對皮膚吸收的影響，并提出了適宜的應用劑量以實現(xiàn)可靠的皮膚吸收。選用咖啡因和睪酮作為測試化合物，采用Franz擴散池進行體外皮膚吸收試驗。將含1%咖啡因和0.1%睪酮的半固體（乳膏）和液體（溶液）制劑，以不同用量（5、10、25、50毫克或微升/平方厘米）分別應用于大鼠和微型豬（Micropig®）皮膚。
24小時后，采用液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）或高效液相色譜（HPLC），測定皮膚表面、角質層、真皮與表皮及受體液中兩種化合物的濃度。結果顯示，在大鼠和微型豬兩種皮膚類型，以及乳膏和溶液兩種制劑中，兩種化合物的皮膚吸收率均隨應用量增加而下降。尤其在50毫克（或微升）/平方厘米用量下，兩種化合物在大鼠和微型豬皮膚中的吸收率，均顯著低于5或10毫克（或微升）/平方厘米用量組。因此，為獲得保守的皮膚吸收數(shù)據(jù)，應采用低劑量（5或10毫克/微升/平方厘米）的制劑進行應用。
體外Franz擴散池設備：
所有大鼠和微型豬（Micropig®）皮膚膜均以真皮面朝下的方式，安裝在Franz擴散池中。該設備配置Vision Microette自動進樣器、循環(huán)水浴鍋、攪拌板、攪拌控制器及自動補液功能（美國加利福尼亞州查茨沃思市漢森公司）。受體液（RF）室體積為12毫升，水浴鍋溫度設定為32.5℃，通過水循環(huán)維持受體液恒溫。受體室中分別裝入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）和含6%（體積分數(shù)）聚乙二醇（PEG）的PBS，分別作為咖啡因和睪酮測試的受體液。
皮膚膜解凍至室溫后安裝到Franz擴散池上，并用生理鹽水水合。使用前，采用英國Biox AquaFlux經(jīng)皮水分流失測量儀評估皮膚膜完整性。暴露1.77平方厘米的皮膚區(qū)域，分別將含1%咖啡因或0.1%睪酮的乳膏或液體制劑，按5、10、25、50毫克/平方厘米或5、10、25、50微升/平方厘米的用量涂抹于暴露區(qū)域。涂抹時，通過無菌注射器向供給室注入約8.85、17.7、44.25和88.5毫克（或微升）的制劑，以保證實驗條件適宜。僅將擴散池標準頂部組件固定在皮膚膜上，最大限度減少采樣過程中的反向擴散。
（Biox AquaFlux經(jīng)皮水分流失測量儀）
隨后，用新鮮受體液沖洗自動進樣器后，采集200微升受體液樣品，采樣時間設定在涂抹后0、1、2、4、8、12和24小時。用BD™酒精棉片將殘留制劑沖洗三次，棉片收集于提取溶劑中（咖啡因用40毫升50%（體積分數(shù)）甲醇，睪酮用20毫升甲醇），全程為每個測試收集沖洗樣品（WASH）。用思高膠帶剝離皮膚表面15次，獲取角質層（SC）上的殘留制劑樣品。將使用過的皮膚膜用手術剪剪成8塊，置于適宜溶劑中提�。ǹХ纫蛴�20毫升50%（體積分數(shù)）甲醇，睪酮用10毫升甲醇），得到皮膚樣品（SKIN）�？偽章拾雌つw樣品和受體液樣品中測得的咖啡因或睪酮總量，與涂抹的咖啡因或睪酮總用量的比值計算。
結論：
總之，為獲取用于暴露風險評估的保守皮膚吸收數(shù)據(jù)，建議乳膏制劑采用5或10毫克/平方厘米的劑量，液體制劑采用5或10微升/平方厘米的劑量。該劑量范圍與現(xiàn)有法規(guī)中的劑量要求相近或更為寬松。根據(jù)韓國化妝品人體表面積使用統(tǒng)計數(shù)據(jù)，該建議劑量范圍也處于韓國各類化妝品每表面積每日用量（0.005714–18.75毫克/平方厘米）及歐洲同類用量（0.01086–15.63毫克/平方厘米）之內，因此所選應用條件具有實際可行性。
本研究采用Franz擴散池進行皮膚吸收測試，該方法可作為動物替代測試方法應用于化妝品研究。所用微型豬（Micropig®）可用于人體器官移植，其剩余皮膚作為實驗供體，相較于大鼠皮膚體外測試方法，在動物倫理方面更具優(yōu)勢。
本研究結果有望適用于其他藥物，即其他藥物可能呈現(xiàn)相似趨勢。通常，皮膚吸收率以“滲透量”占“應用量”的百分比計算，且已知化學物質在無限劑量條件下的滲透量會趨于恒定。
因此，若對其他藥物采用足夠高的應用量（即無限劑量）進行皮膚吸收測試，其滲透量將保持恒定，僅應用量增加，皮膚吸收率預計會下降。Frasch等人也提出，化學物質的應用負荷對皮膚吸收率影響顯著。
本研究有望為化妝品、藥品及各類化學物質的監(jiān)管提供參考。但本研究存在局限性：僅使用了兩種測試物質。若能采用具有不同辛醇-水分配系數(shù)（LogKow）值的測試物質進行多組結果對比，或將研究重復次數(shù)增加，將有助于減少數(shù)據(jù)離散度、提高數(shù)據(jù)一致性。
原文鏈接：
https://doi.org/10.3390/PHARMACEUTICS13050641
參考文獻：
【1】Im, J.-E., Kim, H.Y., Lee, J.D., et al. Effect of Application Amounts on In Vitro Dermal Absorption Test Using Caffeine and Testosterone. Pharmaceutics, 2021, 13(5), 641.
https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13050641
【2】OECD. Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. 2004.
https://doi.org/10.1787/9789264078796-en
【3】Lehman, P.A., Raney, S.G., Franz, T.J. Percutaneous absorptionin man: In vitro-in vivo correlation. Skin Pharmacol. Physiol., 2011,24(5), 224-230.
https://doi.org/10.1159/000330426
引言：
韓國檀國大學Jueng-Eun Im、Kyu-Bong Kim團隊聯(lián)合韓國食品藥品安全評估院等機構，在《Pharmaceutics》（2021年，Vol.13, IF=6.525）發(fā)表研究，通過Biox AquaFlux™ AF200和Hanson Franz擴散池系統(tǒng)，明確了應用量對咖啡因、睪酮體外皮膚吸收的影響，提出了風險評估所需的最優(yōu)應用劑量。
摘要：
化學品的皮膚吸收是風險評估的重要因素。本研究探討了不同應用量對皮膚吸收的影響，并提出了適宜的應用劑量以實現(xiàn)可靠的皮膚吸收。選用咖啡因和睪酮作為測試化合物，采用Franz擴散池進行體外皮膚吸收試驗。將含1%咖啡因和0.1%睪酮的半固體（乳膏）和液體（溶液）制劑，以不同用量（5、10、25、50毫克或微升/平方厘米）分別應用于大鼠和微型豬（Micropig®）皮膚。
24小時后，采用液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）或高效液相色譜（HPLC），測定皮膚表面、角質層、真皮與表皮及受體液中兩種化合物的濃度。結果顯示，在大鼠和微型豬兩種皮膚類型，以及乳膏和溶液兩種制劑中，兩種化合物的皮膚吸收率均隨應用量增加而下降。尤其在50毫克（或微升）/平方厘米用量下，兩種化合物在大鼠和微型豬皮膚中的吸收率，均顯著低于5或10毫克（或微升）/平方厘米用量組。因此，為獲得保守的皮膚吸收數(shù)據(jù)，應采用低劑量（5或10毫克/微升/平方厘米）的制劑進行應用。
體外Franz擴散池設備：
所有大鼠和微型豬（Micropig®）皮膚膜均以真皮面朝下的方式，安裝在Franz擴散池中。該設備配置Vision Microette自動進樣器、循環(huán)水浴鍋、攪拌板、攪拌控制器及自動補液功能（美國加利福尼亞州查茨沃思市漢森公司）。受體液（RF）室體積為12毫升，水浴鍋溫度設定為32.5℃，通過水循環(huán)維持受體液恒溫。受體室中分別裝入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）和含6%（體積分數(shù)）聚乙二醇（PEG）的PBS，分別作為咖啡因和睪酮測試的受體液。
皮膚膜解凍至室溫后安裝到Franz擴散池上，并用生理鹽水水合。使用前，采用英國Biox AquaFlux經(jīng)皮水分流失測量儀評估皮膚膜完整性。暴露1.77平方厘米的皮膚區(qū)域，分別將含1%咖啡因或0.1%睪酮的乳膏或液體制劑，按5、10、25、50毫克/平方厘米或5、10、25、50微升/平方厘米的用量涂抹于暴露區(qū)域。涂抹時，通過無菌注射器向供給室注入約8.85、17.7、44.25和88.5毫克（或微升）的制劑，以保證實驗條件適宜。僅將擴散池標準頂部組件固定在皮膚膜上，最大限度減少采樣過程中的反向擴散。
（Biox AquaFlux經(jīng)皮水分流失測量儀）
隨后，用新鮮受體液沖洗自動進樣器后，采集200微升受體液樣品，采樣時間設定在涂抹后0、1、2、4、8、12和24小時。用BD™酒精棉片將殘留制劑沖洗三次，棉片收集于提取溶劑中（咖啡因用40毫升50%（體積分數(shù)）甲醇，睪酮用20毫升甲醇），全程為每個測試收集沖洗樣品（WASH）。用思高膠帶剝離皮膚表面15次，獲取角質層（SC）上的殘留制劑樣品。將使用過的皮膚膜用手術剪剪成8塊，置于適宜溶劑中提�。ǹХ纫蛴�20毫升50%（體積分數(shù)）甲醇，睪酮用10毫升甲醇），得到皮膚樣品（SKIN）�？偽章拾雌つw樣品和受體液樣品中測得的咖啡因或睪酮總量，與涂抹的咖啡因或睪酮總用量的比值計算。
結論：
總之，為獲取用于暴露風險評估的保守皮膚吸收數(shù)據(jù)，建議乳膏制劑采用5或10毫克/平方厘米的劑量，液體制劑采用5或10微升/平方厘米的劑量。該劑量范圍與現(xiàn)有法規(guī)中的劑量要求相近或更為寬松。根據(jù)韓國化妝品人體表面積使用統(tǒng)計數(shù)據(jù)，該建議劑量范圍也處于韓國各類化妝品每表面積每日用量（0.005714–18.75毫克/平方厘米）及歐洲同類用量（0.01086–15.63毫克/平方厘米）之內，因此所選應用條件具有實際可行性。
本研究采用Franz擴散池進行皮膚吸收測試，該方法可作為動物替代測試方法應用于化妝品研究。所用微型豬（Micropig®）可用于人體器官移植，其剩余皮膚作為實驗供體，相較于大鼠皮膚體外測試方法，在動物倫理方面更具優(yōu)勢。
本研究結果有望適用于其他藥物，即其他藥物可能呈現(xiàn)相似趨勢。通常，皮膚吸收率以“滲透量”占“應用量”的百分比計算，且已知化學物質在無限劑量條件下的滲透量會趨于恒定。
因此，若對其他藥物采用足夠高的應用量（即無限劑量）進行皮膚吸收測試，其滲透量將保持恒定，僅應用量增加，皮膚吸收率預計會下降。Frasch等人也提出，化學物質的應用負荷對皮膚吸收率影響顯著。
本研究有望為化妝品、藥品及各類化學物質的監(jiān)管提供參考。但本研究存在局限性：僅使用了兩種測試物質。若能采用具有不同辛醇-水分配系數(shù)（LogKow）值的測試物質進行多組結果對比，或將研究重復次數(shù)增加，將有助于減少數(shù)據(jù)離散度、提高數(shù)據(jù)一致性。
原文鏈接：
https://doi.org/10.3390/PHARMACEUTICS13050641
參考文獻：
【1】Im, J.-E., Kim, H.Y., Lee, J.D., et al. Effect of Application Amounts on In Vitro Dermal Absorption Test Using Caffeine and Testosterone. Pharmaceutics, 2021, 13(5), 641.
https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13050641
【2】OECD. Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. 2004.
https://doi.org/10.1787/9789264078796-en
【3】Lehman, P.A., Raney, S.G., Franz, T.J. Percutaneous absorptionin man: In vitro-in vivo correlation. Skin Pharmacol. Physiol., 2011,24(5), 224-230.
https://doi.org/10.1159/000330426
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