串聯(lián)重復序列作為基因組中動態(tài)變化的區(qū)域，不僅是遺傳多樣性的來源，也可能成為疾病的起點。當重復單元不斷擴展并超越臨界長度，便可能引發(fā)亨廷頓舞蹈癥、脊髓小腦性共濟失調(diào)等一系列神經(jīng)系統(tǒng)疾病。然而，傳統(tǒng)檢測技術受限于讀長與分辨率，往往難以實現(xiàn)全面、精準的基因分型。如今，PacBio 基于 HiFi 長讀長測序與 CRISPR 靶向富集技術推出 PureTarget 重復序列檢測解決方案，實現(xiàn)在單次檢測中同步解析38個富含串聯(lián)重復序列的神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關基因的重復長度、序列結構與甲基化狀態(tài)，為這類疾病的研究打開了全新的視野。

01 PureTarget重復序列檢測產(chǎn)品參數(shù)

PureTarget repeat expansion panel 2.0包含38個重復序列基因位點，在HiFi測序和串聯(lián)重復基因分型工具（TRGT）卓越準確性的支持下，為38種與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關的重要基因提供了綜合分析。

表1. PureTarget repeat expansion panel 2.0包含38個基因靶標，在1.0版本基礎上新增加的靶標以藍色突出顯示。

02 PureTarget重復序列檢測產(chǎn)品優(yōu)勢

同步檢測甲基化信息

甲基化信息在文庫分子中得以保留，并可在后續(xù)測序中同步檢測甲基化信號。

更好的覆蓋度

捕獲片段的大小偏差更小，使得擴展的重復序列等位基因覆蓋度更好，并可覆蓋高GC%區(qū)域。

更高的準確性

PureTarget重復序列檢測采用基于CRISPR-Cas9的靶向富集技術，避免了因 PCR擴增而產(chǎn)生的復制錯誤，結合HiFi測序可實現(xiàn)更精準的重復序列檢測。

03 PureTarget重復序列檢測產(chǎn)品技術原理與流程

PureTarget重復序列檢測采用CRISPR-Cas9的靶向富集技術，以高分子量（HMW）DNA作為起始樣本，使用Cas9核酸酶和guide RNA的復合物在目標重復區(qū)域的上游和下游精確切割位點處切割DNA。隨后通過末端加A尾和barcoded SMRTbell adapter接頭連接形成SMRTbell文庫分子。對于正常等位基因，序列的長度為4-5 kb，但擴展的重復序列等位基因reads可能更長。對具有長重復序列區(qū)域樣品進行測序表明，在單個read中可實現(xiàn)跨越長度高達35kb的重復序列區(qū)域檢測。

圖1. 基于CRISPR-Cas9靶向富集的PureTarget方法建庫流程

04 PureTarget重復序列檢測產(chǎn)品數(shù)據(jù)表現(xiàn)

PureTarget文庫測序產(chǎn)出的HiFi數(shù)據(jù)可以使用串聯(lián)重復基因分型工具（TRGT）進行分析，以提供更全面的基因分型，結果展示如下：兩個等位基因的精確大小，包括較長的擴展重復序列（圖2左）；甲基化的同步解析（圖2右）；重復序列的單堿基分辨率檢測（圖3）；深度覆蓋檢測到的嵌合情況（圖4）。

圖2. 左圖展示的為具有2950個重復基序（8850 bp）的擴展DMPK等位基因的準確大��；右圖展示了FMR1的圖譜顯示女性攜帶者（NA07537）中擴展等位基因的甲基化一致性

圖3. 左圖展示了復合RFC1的單堿基分辨率檢測，包含致病性“AAGGG”重復基序；右圖展示了FMR1重復序列中的AGG插入序列

圖4. 深度覆蓋捕獲樣本內(nèi)C9orf72重復序列長度分布

訂購信息

PureTarget重復序列檢測解決方案推薦使用Nanobind提取試劑盒進行HMW DNA樣本提取，支持人類血液和細胞等樣品類型。建庫流程使用PureTarget repeat expansion panel 2.0與手動或自動PureTarget Kit搭配使用，同時需要結合Barcoded adapters（SMRTbell adapter index plate 96A-D）接頭以支持后續(xù)多樣本混樣測序。對于手動和自動化文庫制備，測序前均需使用PureTarget cleanup Kit對混樣文庫進行最終清洗。相關試劑盒詳細信息參見下表。

表2. PureTarget重復序列檢測建庫試劑盒概覽

當技術的邊界不斷拓展，我們對生命的理解也隨之深化。PacBio PureTarget 重復序列檢測融合了長讀長測序與靶向富集技術，一次性解析38個疾病靶標基因的長度、序列與甲基化狀態(tài)，為神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病研究提供了高效可靠的解決方案，不僅加速了致病機制的解析，也為臨床診斷與罕見病研究開辟了更清晰的路徑。

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