腦類器官技術(shù) (brain organoid) 已從早期非特異性的“大腦樣結(jié)構(gòu)” (cerebral organoid)，快速發(fā)展到區(qū)域特異 (region-specific) 與多區(qū)域融合 (assembloid)，但“核團(tuán)級(jí) (nucleus-specific identity) ”精度的模型長期稀缺，尤其是延髓等關(guān)鍵生命中樞。脊髓三叉神經(jīng)核 (Spinal Trigeminal Nucleus, SpV) 位于腦干的延髓背側(cè)，是三叉神經(jīng)復(fù)合體的重要組成部分，承擔(dān)將頭面部痛覺、溫度感知等外周感覺信號(hào)上行至丘腦的關(guān)鍵中樞。由于延髓譜系在體外難以精準(zhǔn)誘導(dǎo)、核團(tuán)級(jí)分化門檻高，且缺乏能驗(yàn)證方向性、誘發(fā)性、因果性的通路級(jí)功能工具，人源脊髓三叉神經(jīng)核→丘腦通路模型存在明顯研究空白。

本研究通過WNT激活 + 視黃酸尾端化的組合誘導(dǎo)，定向獲得具有脊髓三叉神經(jīng)核特征的延髓背側(cè)譜系人源類器官 (hmSpVO)，并進(jìn)一步與丘腦類器官 (hThO) 融合，構(gòu)建脊髓三叉神經(jīng)核–丘腦組裝體 (hmSpVO-hThO) 。為驗(yàn)證該投射是否具備真實(shí)的方向性與功能性，作者使用3Brain 高密度3D微電極陣列平臺(tái) (3D HD‑MEA) (BioCAM DupleX 儀器 + CorePlate 3D 芯片 + BrainWave5 軟件)，在脊髓三叉神經(jīng)核側(cè)施加局部電刺激、在丘腦側(cè)進(jìn)行跨區(qū)域記錄，捕獲到“刺激脊髓三叉神經(jīng)核→丘腦側(cè)出現(xiàn)時(shí)間鎖定的誘發(fā)動(dòng)作電位” (evoked spike) 這一因果式電生理響應(yīng)，從而確認(rèn)該體系在體外成功重建了具有生理方向性的三叉–丘腦感覺上行通路。

綜上，本研究首次在體外實(shí)現(xiàn)人源核團(tuán)級(jí)建模與感覺上行通路重建，為疼痛、偏頭痛、三叉神經(jīng)痛等相關(guān)疾病的機(jī)理解析與通路級(jí)藥效評(píng)估提供了新平臺(tái)。相關(guān)成果于 2024 年 10 月發(fā)表在 Cell Stem Cell（IF = 20.4）。

3D HD-MEA驗(yàn)證脊髓三叉神經(jīng)核→丘腦的方向性投射
3Brain 的高密度3D微電極陣列（4096 通道、60µm 電極間距、3.8×3.8mm²感應(yīng)面積）實(shí)現(xiàn)了類器官中的精準(zhǔn)定位刺激與全陣列自發(fā)放電記錄 (full-array spontaneous recording)。借助其立體電極結(jié)構(gòu)，該系統(tǒng)可輕微滲入類器官表層并在組織原位 (in situ) 直接耦合類器官內(nèi)部神經(jīng)元 (圖1A），獲取來源明確的細(xì)胞外動(dòng)作電位 (spikes)。

在本文中，作者在脊髓三叉神經(jīng)核側(cè)以微米級(jí)電極實(shí)施局部刺激 （圖1A），并在丘腦側(cè)同步記錄到清晰的誘發(fā)動(dòng)作電位 （圖1B），從而建立跨核團(tuán)的毫秒級(jí)投射通路（圖1C）。高密度電極帶來的空間采樣能力，使信號(hào)在類器官截面上的傳播路徑得以高分辨率呈現(xiàn)；毫秒級(jí)時(shí)間分辨率則進(jìn)一步量化了刺激‑響應(yīng)的潛伏期與傳播方向有助于區(qū)分局部放電事件與更大尺度的網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)。

圖 1｜3Brain 3D HD‑MEA驗(yàn)證脊髓三叉神經(jīng)核→丘腦誘發(fā)‑響應(yīng)。
(A) 三叉神經(jīng)核–丘腦組裝體的記錄場景，可見組裝體直接貼附在3D電極陣列上，實(shí)現(xiàn)原位測量。
(B)丘腦側(cè)記錄到的平均放電頻率隨時(shí)間的變化。當(dāng)在三叉神經(jīng)核區(qū)域施加局部電刺激（共十次）時(shí)，丘腦側(cè)立即出現(xiàn)頻繁而時(shí)間鎖定的動(dòng)作電位峰值，其幅度與密度均明顯高于刺激前。
(C) 對(duì)基線與刺激條件下的丘腦放電頻率進(jìn)行配對(duì)比較，結(jié)果顯示刺激條件下的平均放電率明顯升高。

3D HD-MEA實(shí)驗(yàn)流程
01. 樣本接種
脊髓三叉神經(jīng)核–丘腦組裝體直接鋪設(shè)于 3Brain BioCAM DupleX平臺(tái)搭配的CorePlate 3D芯片上，芯片表面覆蓋一層透明聚酯膜濾片以確保樣本充分貼合并獲得穩(wěn)定接觸。隨后，將組裝體靜置20min以完成沉降與原位固定。

02. HD‑MEA 數(shù)據(jù)采集（在BrainWave 5中配置）
刺激設(shè)置 | 在三叉神經(jīng)核側(cè)選取電極作為刺激點(diǎn)，并將相鄰的兩個(gè)電極設(shè)為正極、另兩個(gè)相鄰電極設(shè)為負(fù)極，兩極之間間隔一個(gè)電極以形成局部化且穩(wěn)定的刺激場。刺激參數(shù)設(shè)定為脈沖時(shí)長 50ms、刺激強(qiáng)度 65µA，共施加10次刺激、每次間隔 10s。

記錄階段 | 位于丘腦側(cè)的多通道電極用于同步并行記錄神經(jīng)活動(dòng)，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)同步保留所有刺激觸發(fā)的時(shí)間戳，便于后續(xù)進(jìn)行刺激-響應(yīng)對(duì)齊分析。

03. 數(shù)據(jù)分析
原始數(shù)據(jù)在BrainWave5 軟件中完成全套預(yù)處理與分析流程，包括以 100Hz 高通濾波去除低頻漂移與慢波信息，并使用內(nèi)置算法進(jìn)行spike檢測與分揀。隨后，以刺激事件作為時(shí)間零點(diǎn)，將刺激前后窗口對(duì)齊，用于量化誘發(fā)響應(yīng)的平均放電率（MFR）、刺激‑響應(yīng)的潛伏期與重復(fù)性指標(biāo)；并通過比較基線與刺激條件條件下的放電差異 （圖1C）驗(yàn)證功能性連接。

討論與展望：
隨著核團(tuán)級(jí)類器官和通路級(jí)類聯(lián)合體的興起，類腦研究正在從關(guān)注細(xì)胞類型與結(jié)構(gòu)特征，邁向關(guān)注信息如何在體外模型中被編碼、傳遞與調(diào)控。在這一代際轉(zhuǎn)變中，模型的價(jià)值不再由“像不像真實(shí)組織”決定，而是取決于它是否能以功能方式參與神經(jīng)計(jì)算：能否被刺激？能否產(chǎn)生可量化的響應(yīng)？能否體現(xiàn)生理方向性？能否作為通路級(jí)藥理學(xué)的讀出窗口？

這種轉(zhuǎn)變讓 3Brain 3D技術(shù)平臺(tái)的角色變得尤為關(guān)鍵——它不是一個(gè)記錄工具，而是功能類器官和神經(jīng)通路模型得以成立的基礎(chǔ)接口。HD‑MEA提供的刺激‑響應(yīng)能力、跨區(qū)域時(shí)序解析以及通路級(jí)readout，使類器官由“結(jié)構(gòu)模型”升級(jí)為真正的“功能單元”。無論研究對(duì)象是三叉‑丘腦通路、皮層‑丘腦互作，還是 CGRP、5‑HT這類藥物在體外通路上的作用模式，3Brain 提供讓這些問題可觀察、可驗(yàn)證、可迭代的研究能力。

參考與圖片來源
Pang, W., Zhu, J., Yang, K., Zhu, X., Zhou, W., Jiang, L., Zhuang, X., Liu, Y., Wei, J., & Lu, X. (2024). Generation of human region‑specific brain organoids with medullary spinal trigeminal nuclei. Cell Stem Cell,31, 1501–1512. https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.08.004

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3Brain 鏈接未來，加速藥物發(fā)現(xiàn)

文章轉(zhuǎn)自：應(yīng)用解讀 | Cell Stem Cell 向陽飛團(tuán)隊(duì)構(gòu)建人類延髓脊髓三叉神經(jīng)核與丘腦的體外通路