一、引言
實時、定量監(jiān)測活細胞內的分子事件，如蛋白質-蛋白質相互作用、蛋白質穩(wěn)定性及基因表達調控，是細胞生物學研究及藥物發(fā)現領域的核心需求�；�于熒光素酶的報告基因技術因其高靈敏度、寬線性范圍和操作簡便性而得到廣泛應用。近年來，新型小分子熒光素酶（NanoLuc）及其片段化技術的出現，進一步提升了檢測性能。本文旨在介紹一種基于分裂NanoLuc技術的活細胞檢測系統，闡述其技術原理、核心優(yōu)勢及標準操作流程。

二、技術原理與設計基礎
該系統基于分裂熒光素酶互補技術構建。其核心技術元件是將微熒光素酶（NanoLuc）在特定結構位點分割為兩個無獨立催化活性的多肽片段：一個大片段（Large Bit, LgBit）和一個小片段（Small Bit, SmBit）。

在應用設計中，這兩個片段可分別與待研究的兩個目標蛋白融合表達。當目標蛋白發(fā)生相互作用或處于同一復合物中時，LgBit與SmBit在空間上相互靠近，重構出完整的NanoLuc活性構象。在細胞滲透性、高靈敏度底物存在的條件下，重構的酶催化底物產生高強度、可持續(xù)的生物發(fā)光信號。

根據片段間固有親和力的差異，該技術可適用于不同研究場景。高親和力組合的片段可自發(fā)快速互補，適用于監(jiān)測總蛋白表達水平或作為生物傳感器的基礎；而基于目標蛋白相互作用驅動的低親和力片段互補，則專門用于研究蛋白復合物的動態(tài)形成。

三、活細胞檢測系統的核心優(yōu)勢
將上述技術與優(yōu)化的活細胞檢測試劑相結合，形成的完整系統具備多項顯著的技術優(yōu)勢，特別適用于高通量篩選（HTS）和實時動力學分析。

1. 高靈敏度與低背景：NanoLuc酶本身具有比傳統螢火蟲或海腎熒光素酶更高的比活性，結合可透過細胞膜的優(yōu)化底物，能夠在活細胞中檢測到微弱的相互作用信號。由于未互補的片段無活性，背景信號極低，信噪比高。

2. 信號穩(wěn)定，適合HTS：在檢測條件下，重構酶催化產生的發(fā)光信號半衰期可達約2小時。這種“輝光型”信號特征允許批量處理樣品，無需嚴格的計時加樣，極大地便利了自動化高通量篩選平臺的運行。

3. 均質檢測，維持細胞活性：系統配備了可透過細胞膜的底物，無需裂解細胞。操作時僅需將檢測試劑直接加入培養(yǎng)板，即可實現對活細胞群內事件的實時讀取，支持對同一批樣品進行多時間點動態(tài)監(jiān)測，或進行后續(xù)的細胞功能分析。

4. 操作靈活，適應性強：產品組分經過優(yōu)化，可根據不同的實驗目的（如追求最高信號、最佳細胞狀態(tài)或最簡操作步驟）選擇不同的檢測方法，兼容不同規(guī)格的微孔板。

四、標準化操作流程要點
為確保檢測結果的準確性與可重復性，需遵循標準化的操作流程，其關鍵環(huán)節(jié)包括：
1. 細胞模型構建：將目標基因分別與LgBit和SmBit片段編碼框融合，構建表達載體。通過瞬時轉染或建立穩(wěn)定細胞系，導入適宜的宿主細胞（如HEK293）中。

2. 細胞鋪板與處理：在白色透明底的細胞培養(yǎng)板中接種適量細胞，以確保實驗時細胞密度適宜。根據實驗設計，對細胞進行藥物處理、基因干預等操作，并培養(yǎng)至目標蛋白表達和相互作用發(fā)生的合適時間點。

3. 試劑平衡與準備：將檢測緩沖液平衡至室溫（22-25℃）。NanoLuc底物置于冰上融化，使用前按1:200的比例用緩沖液新鮮配制成1×檢測工作液，并注意避光。

4. 檢測與信號讀取：將細胞培養(yǎng)板平衡至室溫。可選擇棄去培養(yǎng)液后直接加檢測液（獲得最高信號）或保留部分培養(yǎng)基以維持細胞更好狀態(tài)。加入檢測液后，室溫避光孵育10分鐘，使反應達到平衡。最后，使用配備發(fā)光檢測模塊的多功能酶標儀讀取發(fā)光信號值。

5. 數據解讀：發(fā)光信號的強度直接反映LgBit與SmBit的互補程度，進而定量表征目標蛋白間的相互作用強度或目標蛋白的表達水平。

五、結論
綜上所述，基于分裂NanoLuc技術的UA-Glo®活細胞檢測系統，通過創(chuàng)新的酶片段設計和優(yōu)化的細胞通透性底物，實現了對活細胞內分子事件的高靈敏度、實時、均質化檢測。其信號穩(wěn)定、操作簡便、背景低的特點，使其成為基礎研究探索蛋白質功能以及在藥物研發(fā)領域進行高通量化合物篩選的有力工具。嚴格遵循標準化操作流程，是發(fā)揮該系統性能、獲得可靠數據的關鍵。