概要
VPS4B（液泡蛋白分選相關(guān)蛋白4B）是減數(shù)分裂亞群AAA ATP酶家族（meiotic clade AA ATPase）成員，該類酶以寡聚體形式發(fā)揮功能，通過ATP水解驅(qū)動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。VPS4B在某些癌癥中過表達(dá)，且與其同源蛋白VPS4A存在合成致死關(guān)系，使VPS4B成為具有潛力的治療靶點(diǎn)。本研究開發(fā)了一種基于VPS4B抑制劑的篩選與分析技術(shù)平臺(tái)。該平臺(tái)的核心是結(jié)合Transcreener^® ADP² Assay與SPT Labtech dragonfly^® discovery非接觸式加樣技術(shù)進(jìn)行ATP酶活性測定，旨在通過流程優(yōu)化，最大限度減少實(shí)驗(yàn)的不穩(wěn)定，確保篩選結(jié)果的可靠且準(zhǔn)確。

我們采用Transcreener^® ADP² FP成功檢測了VPS4B ATP酶的初始活性，在100 nM酶濃度條件下，總偏振位移約150 mP。借助dragonfly^® discovery平臺(tái)進(jìn)行分液操作，在384孔板和1536孔板中測得的Z'因子分別高于0.9和0.8。針對(duì)1280種生物活性化合物進(jìn)行的初步篩選顯示陽性率為1%，干擾率為0.1%。其中一個(gè)陽性化合物在后續(xù)的劑量反應(yīng)復(fù)篩實(shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證，且手動(dòng)分液與dragonfly^® discovery系統(tǒng)測得的IC₅₀值高度一致。 本研究證明，SPT Labtech的dragonfly^® discovery與Transcreener^® ADP² Assay聯(lián)用，可為VPS4B抑制劑研發(fā)提供了一個(gè)穩(wěn)定便捷的技術(shù)平臺(tái)。

dragonfly^® discovery多功能分液工作站

圖1. dragonfly discovery是一款基于固相置換原理的非接觸式微量分液器

SPT Labtech 開發(fā)的dragonfly discovery分液系統(tǒng)能夠在200 nL至4 mL的超寬量程范圍內(nèi)，實(shí)現(xiàn)高度精準(zhǔn)且可重復(fù)的非接觸式分液，即便處理高粘度試劑依然表現(xiàn)出色，適用于各類SBS標(biāo)準(zhǔn)微孔板（包括384孔和1536孔板）。其基于固相置換技術(shù)的零校準(zhǔn)、低維護(hù)設(shè)計(jì)，可快速完成儀器配置與實(shí)驗(yàn)流程（protocol）設(shè)定，尤其適用于微縮化高通量篩選（HTS）。該系統(tǒng)不僅有助于節(jié)約珍貴試劑與耗材，還能有效提升檢測體系的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)可靠性。
其最多配備10個(gè)通道，每個(gè)通道既可完全獨(dú)立運(yùn)行，又可同步操作，從而實(shí)現(xiàn)快速且高度靈活的非接觸式分液。這種設(shè)計(jì)不僅支持在高密度1536孔板中進(jìn)行復(fù)雜的試劑梯度組合以完成方法學(xué)開發(fā)和驗(yàn)證，也能進(jìn)行常規(guī)試劑的高通量和快速分裝。

Transcreener^®ADP² Assay檢測方法

圖2. Transcreener ADP² Assay是一種基于遠(yuǎn)紅光的競爭性檢測方法，
通過定量ADP生成量來測定酶活性

Transcreener^®檢測技術(shù)基于高度特異性抗體，在均相反應(yīng)體系中直接識(shí)別與定量核苷酸，并通過遠(yuǎn)紅外熒光輸出檢測信號(hào)。Transcreener^®檢測專為高通量篩選設(shè)計(jì)，采用單次加樣、混勻即讀的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ�，具備�?yōu)異的試劑穩(wěn)定性，且兼容各類主流多功能酶標(biāo)儀品牌。該檢測平臺(tái)提供熒光偏振（FP）、熒光強(qiáng)度（FI）及時(shí)間分辨熒光能量共振轉(zhuǎn)移（TR-FRET）三種檢測模式。相較于依賴間接測量或多步操作的ADP檢測方法，Transcreener^®流程更簡化，具備更高的靈敏度與信噪比。其“加樣混勻即讀”的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ�，結(jié)合試劑穩(wěn)定的性能表現(xiàn)，使其尤其適用于自動(dòng)化工作流程的整合與應(yīng)用。
該技術(shù)采用簡潔高效的實(shí)驗(yàn)原理，并使用了一種特異性識(shí)別ADP而非ATP的抗體及遠(yuǎn)紅光熒光示蹤劑。反應(yīng)中生成的ADP與熒光示蹤劑競爭結(jié)合抗體，通過改變熒光特性輸出可讀信號(hào)。

基于ADP² FP方法的VPS4B活性酶檢測

圖3. 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

A. 在含有8 μM ATP的酶活檢測緩沖液A（50 mM HEPES pH 7.5、10 mM MgCl₂、50 mM KCl、5 mM DTT、0.01% Triton）中，分別通過手動(dòng)移液和dragonfly^® discovery平臺(tái)對(duì)VPS4B蛋白進(jìn)行梯度稀釋，并在37℃條件下孵育2小時(shí)。B. 將酶活性轉(zhuǎn)換為ADP生成量后擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線，證實(shí)手動(dòng)移液與dragonfly^® discovery分液所測得的酶活反應(yīng)速率具有良好的一致性。

基于ADP² FP方法的Z'因子測定

圖4. 手動(dòng)和dragonfly discovery實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

在12個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)上，分別用384孔板（A）與1536孔板（B）測定了Z'因子。上半部分圖表展示手動(dòng)移液操作的Z’因子值；下半部分圖表則為通過 dragonfly^® discovery 分液所得的Z’因子值。
 

VPS4B酶抑制劑初篩

圖5. VPS4B ATP酶預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選

采用Transcreener^® ADP² FP檢測法對(duì)Tocris 2.0化合物庫中的1280個(gè)化合物進(jìn)行篩選，共鑒定出13個(gè)偏振值高于3倍標(biāo)準(zhǔn)差的潛在抑制劑；其中12個(gè)化合物對(duì)檢測體系無干擾效應(yīng)。

劑量反應(yīng)曲線和IC₅₀分析

圖6. 劑量反應(yīng)分析

A. 從初篩中獲得的陽性化合物ESI-09及對(duì)照化合物Suramin的劑量反應(yīng)曲線，實(shí)驗(yàn)在384孔板中進(jìn)行。其中，對(duì)照化合物Suramin的IC₅₀值在手動(dòng)移液和 dragonfly^® discovery 平臺(tái)上分別是B. 2.3 μM和C. 2.9 μM。

結(jié)論

• Transcreener^® ADP²檢測技術(shù)采用均相熒光偏振法，可實(shí)現(xiàn)VPS4B酶活性的直接定量測定。

• 該技術(shù)與SPT Labtech的dragonfly^® discovery平臺(tái)聯(lián)用后，該檢測體系展現(xiàn)出優(yōu)異的數(shù)據(jù)質(zhì)量（Z'因子持續(xù)高于0.8，信號(hào)窗口穩(wěn)定），為高通量篩選流程提供了可靠支撐。

• 在384孔板和1536孔板中的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，dragonfly^® discovery與Transcreener^®檢測技術(shù)具有良好的板型適應(yīng)性，在不同規(guī)格微孔板中均表現(xiàn)出高度可重復(fù)的穩(wěn)定性能。

• 自動(dòng)化非接觸式分液功能顯著簡化了酶滴定、方法學(xué)開發(fā)及化合物庫篩選等操作流程，有效提升了實(shí)驗(yàn)通量與數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。

• 初步篩選研究進(jìn)一步驗(yàn)證了該檢測體系在藥物研發(fā)中的適用性，成功鑒定出多個(gè)VPS4B抑制劑并測得其IC₅₀值，結(jié)果可靠，充分展現(xiàn)了該方案在VPS4B及相關(guān)ATP酶研究中的應(yīng)用潛力。