單核來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)攻略
本流程以磁珠分選陽(yáng)性選擇法為核心，完成人源 CD14 + 單核細(xì)胞的分選，并開(kāi)展后續(xù)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的誘導(dǎo)分化，為后續(xù)人源樹(shù)突狀細(xì)胞功能驗(yàn)證及 T 細(xì)胞激活功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與操作依據(jù)。
一、人源樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)及T細(xì)胞激活功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
1,在確定外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs） 的大致總數(shù)后，棄去最后一次離心產(chǎn)生的上清液，將沉淀物按每10 7個(gè)細(xì)胞80 μl 的比例重懸于磁珠緩沖液（附錄II） 中 。 隨后通過(guò)加入20 μl 溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。
2,CD14微珠按供應(yīng)商規(guī)格配置，每10 7個(gè)細(xì)胞使用一個(gè)微珠 。將細(xì)胞懸液充分混勻后置于4 ºC 培養(yǎng)箱中孵育 。 15分鐘后，加入微珠緩沖液將細(xì)胞稀釋至終體積10毫升， 以250g（1200轉(zhuǎn)/分鐘） 離心10分鐘進(jìn)行洗滌 。 隨后將沉淀物再次稀釋，此時(shí)細(xì)胞濃度為10 ^8個(gè)/500 μl ，即可進(jìn)行磁珠分離。
3,與此同時(shí)， 將LS層析柱置于分離器的磁場(chǎng)環(huán)境中， 并用3毫升磁珠緩沖液進(jìn)行沖洗 。待柱體儲(chǔ)液槽排空后，將細(xì)胞懸液上樣至柱體并收集流出液 。 隨后使用3毫升磁珠緩沖液對(duì)柱體進(jìn)行三次洗滌，每次洗滌前必須確保儲(chǔ)液槽完全排空 。此時(shí)收集的總流出液僅包含未標(biāo)記細(xì)胞（CD14-） ，即分離過(guò)程中的陰性組分。
4,為獲取標(biāo)記細(xì)胞（陽(yáng)性組分） ，將層析柱轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，并加入5 ml磁珠緩沖液進(jìn)行上樣。
5.隨后，將配備色譜柱的柱塞立即投入使用，并收集洗脫組分 。該洗脫組分即為目標(biāo)CD14+ 細(xì)胞組分 。分離后的細(xì)胞在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中進(jìn)行計(jì)數(shù)， 并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制評(píng)估 。 分離細(xì)胞經(jīng)250g（1200轉(zhuǎn)/分鐘） 離心10分鐘后 ，重懸于冷凍培養(yǎng)基中， 細(xì)胞濃度為6.25 × 10 ^6個(gè)/毫升， 隨后于-80 ºC 條件下冷凍保存以備后續(xù)使用。CD4+ T細(xì)胞分選同理。
單核細(xì)胞（CD14+ 細(xì)胞）分離完成后，將其重懸于培養(yǎng)基 中 ，濃度為1× 10 6個(gè)細(xì)胞/毫升， 并添加750 U/mL白細(xì)胞介素（IL）-4和1000 U/mL粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF） 以促進(jìn)其向樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）分化 。 隨后將細(xì)胞懸液分裝至24孔培養(yǎng)板（每孔1 ml）中。
細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱 中 ， 并在37 ºC 、 含5%CO2 的濕潤(rùn)環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng) 。 每隔兩天， 輕柔地移除一半培養(yǎng)基， 并替換為等量新鮮培養(yǎng)基 ， 同時(shí)補(bǔ)充與先前所述相同濃度的IL-4和GM-CSF 。經(jīng)過(guò)7天的細(xì)胞因子培養(yǎng)后 ，單核細(xì)胞已分化為樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs） ， 為評(píng)估其成熟度及細(xì)胞死亡率，這些細(xì)胞被移出培養(yǎng)體系。
此時(shí)可能需要確定分化效率， 該指標(biāo)將初始待分化的樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）數(shù)量與單核細(xì)胞數(shù)量相關(guān)聯(lián)。
試劑及耗材清單
一、人源樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)及T細(xì)胞激活功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
1,在確定外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs） 的大致總數(shù)后，棄去最后一次離心產(chǎn)生的上清液，將沉淀物按每10 7個(gè)細(xì)胞80 μl 的比例重懸于磁珠緩沖液（附錄II） 中 。 隨后通過(guò)加入20 μl 溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。
2,CD14微珠按供應(yīng)商規(guī)格配置，每10 7個(gè)細(xì)胞使用一個(gè)微珠 。將細(xì)胞懸液充分混勻后置于4 ºC 培養(yǎng)箱中孵育 。 15分鐘后，加入微珠緩沖液將細(xì)胞稀釋至終體積10毫升， 以250g（1200轉(zhuǎn)/分鐘） 離心10分鐘進(jìn)行洗滌 。 隨后將沉淀物再次稀釋，此時(shí)細(xì)胞濃度為10 ^8個(gè)/500 μl ，即可進(jìn)行磁珠分離。
3,與此同時(shí)， 將LS層析柱置于分離器的磁場(chǎng)環(huán)境中， 并用3毫升磁珠緩沖液進(jìn)行沖洗 。待柱體儲(chǔ)液槽排空后，將細(xì)胞懸液上樣至柱體并收集流出液 。 隨后使用3毫升磁珠緩沖液對(duì)柱體進(jìn)行三次洗滌，每次洗滌前必須確保儲(chǔ)液槽完全排空 。此時(shí)收集的總流出液僅包含未標(biāo)記細(xì)胞（CD14-） ，即分離過(guò)程中的陰性組分。
4,為獲取標(biāo)記細(xì)胞（陽(yáng)性組分） ，將層析柱轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，并加入5 ml磁珠緩沖液進(jìn)行上樣。
5.隨后，將配備色譜柱的柱塞立即投入使用，并收集洗脫組分 。該洗脫組分即為目標(biāo)CD14+ 細(xì)胞組分 。分離后的細(xì)胞在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中進(jìn)行計(jì)數(shù)， 并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制評(píng)估 。 分離細(xì)胞經(jīng)250g（1200轉(zhuǎn)/分鐘） 離心10分鐘后 ，重懸于冷凍培養(yǎng)基中， 細(xì)胞濃度為6.25 × 10 ^6個(gè)/毫升， 隨后于-80 ºC 條件下冷凍保存以備后續(xù)使用。CD4+ T細(xì)胞分選同理。
單核細(xì)胞（CD14+ 細(xì)胞）分離完成后，將其重懸于培養(yǎng)基 中 ，濃度為1× 10 6個(gè)細(xì)胞/毫升， 并添加750 U/mL白細(xì)胞介素（IL）-4和1000 U/mL粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF） 以促進(jìn)其向樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）分化 。 隨后將細(xì)胞懸液分裝至24孔培養(yǎng)板（每孔1 ml）中。
細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱 中 ， 并在37 ºC 、 含5%CO2 的濕潤(rùn)環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng) 。 每隔兩天， 輕柔地移除一半培養(yǎng)基， 并替換為等量新鮮培養(yǎng)基 ， 同時(shí)補(bǔ)充與先前所述相同濃度的IL-4和GM-CSF 。經(jīng)過(guò)7天的細(xì)胞因子培養(yǎng)后 ，單核細(xì)胞已分化為樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs） ， 為評(píng)估其成熟度及細(xì)胞死亡率，這些細(xì)胞被移出培養(yǎng)體系。
此時(shí)可能需要確定分化效率， 該指標(biāo)將初始待分化的樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）數(shù)量與單核細(xì)胞數(shù)量相關(guān)聯(lián)。
試劑及耗材清單
|
用途 |
產(chǎn)品編號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
品牌 |
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PBMC獲得 |
人淋巴細(xì)胞分離液 |
Absin |
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單核細(xì)胞獲得 |
CD14 Nanobeads, human (RUO) |
Starter |
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T細(xì)胞獲得 |
S0B5740 |
CD4 Nanobeads, human (RUO) |
Starter |
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T細(xì)胞激活 |
NA/LE Mouse anti-human CD3 mAb |
Starter |
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T細(xì)胞激活 |
NA/LE Mouse anti-human CD28 mAb |
Starter |
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IL-4細(xì)胞因子 |
IL-4 Protein, Human |
UA |
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GM-CSF細(xì)胞因子 |
GM-CSF Protein, Human |
UA |
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IL-6細(xì)胞因子 |
IL-6 Protein, Human |
UA |
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TNF細(xì)胞因子 |
TNF-α Protein, Human |
UA |
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細(xì)胞增殖檢測(cè) |
CFSE |
Absin |
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流式檢測(cè) |
- |
CD14, CD11C, CD80, CD86, HLA-DR, CD209, CD3, CD4, CD8, CD69, KI-67 (流式檢測(cè)抗體) |
Starter |
|
細(xì)胞因子檢測(cè) |
- |
IL-2, TNF, IFN (ELISA試劑盒) |
LabEx |
標(biāo)簽：
細(xì)胞分選
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