全人源TCS肝細胞三培養(yǎng)體系在肝毒性評估中的應用
全人源TCS肝細胞三培養(yǎng)體系與肝毒性評估
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全人源TCS肝毒評估核心看點
預測藥物及化學物質(zhì)誘導的肝毒性仍是一項重要挑戰(zhàn)。藥物研發(fā)過程中的基于動物的實驗常無法識別此類風險，因其難以模擬非實質(zhì)細胞在應對化合物干擾及疾病進展中的作用。傳統(tǒng)的體外肝臟模型系統(tǒng)，例如原代人肝細胞單層培養(yǎng)，缺乏關鍵功能，或隨著時間的推移，細胞結構和完整性會喪失。
本研究開發(fā)了一種全人源三培養(yǎng)體系（Tri-Culture System,TCS），分為24孔板和96孔板兩種規(guī)格，由原代人肝細胞（Primary Human Hepatocytes, PHHs）與源自捐贈人體組織的內(nèi)皮細胞和基質(zhì)細胞組成。我們通過檢測關鍵細胞間相互作用和連接極性標志物的定位、白蛋白和尿素的合成以及CYP酶的基礎活性和誘導活性，在4周內(nèi)評估了關鍵自組裝細胞結構和功能的恢復和維持情況，從而確定了最合適的細胞密度和比例。對來自多位健康及患病供體的肝細胞進行單培養(yǎng)與三培養(yǎng)對比實驗，結果顯示：單培養(yǎng)體系中，白蛋白和尿素的基礎合成速率、CYP酶基礎活性及誘導活性均明顯下降（白蛋白和尿素合成量下降超過50%，因細胞流失導致CYP基礎表達水平檢測不到）；而TCS中，上述細胞與生化指標在培養(yǎng)初期4-7天內(nèi)升高，于7-10天達到穩(wěn)態(tài)水平（白蛋白和尿素表達量維持在20%的范圍內(nèi)，CYP酶誘導倍數(shù)變化超過10倍）。這些結果直接與ZO-1和Cx32介導的細胞間相互作用和細胞連接促進的肝細胞重塑以及功能性膽小管的形成相對應。無論供體背景如何，非實質(zhì)細胞的存在可在數(shù)周培養(yǎng)期內(nèi)維持并增強肝細胞的完整性、極性及功能。綜上，該全人源三培養(yǎng)體系為研究藥物對健康及患病供體肝細胞功能的有效性與潛在毒性，提供了一種具有前景的新型分析工具。
一、全人源TCS體系：研究背景與目的
這項研究旨在開發(fā)并驗證一種全人源肝細胞共培養(yǎng)模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)可長期維持肝細胞的表型結構、肝臟基本功能及代謝能力，適用于病理學與毒理學研究。有研究表明，利用小鼠3T3成纖維細胞共培養(yǎng)可增強細胞完整性、對受體激動劑的應答能力及代謝功能（1-3）。然而，目前仍需要一種全人源且供體匹配的共培養(yǎng)體系，以模擬肝損傷及疾病進展過程中的細胞間事件。本研究描述了一種全人源肝細胞三培養(yǎng)體系（TCS），該系統(tǒng)實現(xiàn)了維持來自多個供體（代表不同正常和病變肝組織背景）的人類肝細胞批次的結構完整性和基本功能的初步目標。
二、全人源TCS體系：肝細胞培養(yǎng)與功能檢測方法
1.肝細胞培養(yǎng)體系
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全人源TCS肝毒評估核心看點
預測藥物及化學物質(zhì)誘導的肝毒性仍是一項重要挑戰(zhàn)。藥物研發(fā)過程中的基于動物的實驗常無法識別此類風險，因其難以模擬非實質(zhì)細胞在應對化合物干擾及疾病進展中的作用。傳統(tǒng)的體外肝臟模型系統(tǒng)，例如原代人肝細胞單層培養(yǎng)，缺乏關鍵功能，或隨著時間的推移，細胞結構和完整性會喪失。
本研究開發(fā)了一種全人源三培養(yǎng)體系（Tri-Culture System,TCS），分為24孔板和96孔板兩種規(guī)格，由原代人肝細胞（Primary Human Hepatocytes, PHHs）與源自捐贈人體組織的內(nèi)皮細胞和基質(zhì)細胞組成。我們通過檢測關鍵細胞間相互作用和連接極性標志物的定位、白蛋白和尿素的合成以及CYP酶的基礎活性和誘導活性，在4周內(nèi)評估了關鍵自組裝細胞結構和功能的恢復和維持情況，從而確定了最合適的細胞密度和比例。對來自多位健康及患病供體的肝細胞進行單培養(yǎng)與三培養(yǎng)對比實驗，結果顯示：單培養(yǎng)體系中，白蛋白和尿素的基礎合成速率、CYP酶基礎活性及誘導活性均明顯下降（白蛋白和尿素合成量下降超過50%，因細胞流失導致CYP基礎表達水平檢測不到）；而TCS中，上述細胞與生化指標在培養(yǎng)初期4-7天內(nèi)升高，于7-10天達到穩(wěn)態(tài)水平（白蛋白和尿素表達量維持在20%的范圍內(nèi)，CYP酶誘導倍數(shù)變化超過10倍）。這些結果直接與ZO-1和Cx32介導的細胞間相互作用和細胞連接促進的肝細胞重塑以及功能性膽小管的形成相對應。無論供體背景如何，非實質(zhì)細胞的存在可在數(shù)周培養(yǎng)期內(nèi)維持并增強肝細胞的完整性、極性及功能。綜上，該全人源三培養(yǎng)體系為研究藥物對健康及患病供體肝細胞功能的有效性與潛在毒性，提供了一種具有前景的新型分析工具。
一、全人源TCS體系：研究背景與目的
這項研究旨在開發(fā)并驗證一種全人源肝細胞共培養(yǎng)模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)可長期維持肝細胞的表型結構、肝臟基本功能及代謝能力，適用于病理學與毒理學研究。有研究表明，利用小鼠3T3成纖維細胞共培養(yǎng)可增強細胞完整性、對受體激動劑的應答能力及代謝功能（1-3）。然而，目前仍需要一種全人源且供體匹配的共培養(yǎng)體系，以模擬肝損傷及疾病進展過程中的細胞間事件。本研究描述了一種全人源肝細胞三培養(yǎng)體系（TCS），該系統(tǒng)實現(xiàn)了維持來自多個供體（代表不同正常和病變肝組織背景）的人類肝細胞批次的結構完整性和基本功能的初步目標。
二、全人源TCS體系：肝細胞培養(yǎng)與功能檢測方法
1.肝細胞培養(yǎng)體系
- 單培養(yǎng)樣本制備：將凍存原代人肝細胞（PHH）以150,000-250,000個細胞/cm²的密度（因細胞批次而異）接種于膠原包被的24孔板中，次日添加基質(zhì)膠覆蓋，構建三明治培養(yǎng)體系（Sandwich Culture,SC）。
- 全人源三培養(yǎng)體系（TCS）制備：在膠原包被的24孔板中接種飼養(yǎng)細胞，于37℃孵育30分鐘后，加入凍存原代人肝細胞（PHH），接種密度為150,000-250,000個細胞/cm²（因細胞批次而異）。
- 形態(tài)學評估：在3-6周培養(yǎng)期內(nèi)觀察各培養(yǎng)模型的細胞形態(tài)。
- CYP酶誘導活性檢測：培養(yǎng)1周后，分別用原型受體激動劑奧美拉唑（100µM）、CITCO（100nM）或利福平（25µM）處理三明治培養(yǎng)體系（SC）和三培養(yǎng)體系（TCS）中的肝細胞48小時，分別誘導CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4酶，采用P450-Glo檢測試劑盒測定CYP酶活性。
- 白蛋白與尿素分泌檢測：在培養(yǎng)24小時后，使用ELISA試劑盒，在特定時間點檢測收集的培養(yǎng)基樣本中的白蛋白和尿素分泌情況。
- 免疫熒光染色：評估原代人肝細胞（PHH）簇、飼養(yǎng)細胞、緊密連接及間隙連接的定位；采用5(6)-羧基-2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（CDFDA）染色驗證膽小管的形成及MRP-2轉運蛋白的功能；使用抗體定位TCS中的�；悄懰徕c共轉運多肽（NTCP）。
圖.肝細胞培養(yǎng)的材料與方法
三、TCS體系：肝細胞長期培養(yǎng)及酶活性檢測結果
圖1.全人源三培養(yǎng)體系（TCS）示意圖：左側為自組裝肝細胞簇的俯視圖，右側為肝細胞簇與混合滋養(yǎng)細胞層整合的側視圖。
圖2.三培養(yǎng)體系（TCS）中肝細胞形態(tài)完整性（成簇能力）的維持。每張圖像為同一視野，放大倍數(shù)：100倍。
圖3.培養(yǎng)14天時三培養(yǎng)體系（TCS）中肝細胞極性及功能的恢復。A：白蛋白（ALB，紅色）、CD31（綠色）、DAPI（藍色）染色；B：功能性膽小管形成（CDFDA染色）；C：緊密連接染色（ZO-1）；D：縫隙連接染色（CX-32）；E、F：乙肝病毒（HBV）受體（NTCP）染色。放大倍數(shù)：A、B、E=100倍；C、D=200倍；F=400倍。
圖4.3名不同供體的原代人肝細胞（PHH）以單批次或混合批次形式在三培養(yǎng)體系（TCS）中培養(yǎng)長達6周的代表性圖像。放大倍數(shù)：100倍。
圖5.在SC和TCS培養(yǎng)體系下，3個不同PHH批次在培養(yǎng)42天內(nèi)的白蛋白分泌情況。
圖6.3個不同批次的原代人肝細胞（PHH）在三明治培養(yǎng)體系（SC）和三培養(yǎng)體系（TCS）中培養(yǎng)35天內(nèi)，利福平誘導的CYP3A4酶活性變化。
圖7.培養(yǎng)第7天，三明治培養(yǎng)體系（SC）與三培養(yǎng)體系（TCS）中CYP酶（CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4）誘導活性對比。
四、TCS體系肝細胞培養(yǎng)研究結論與展望
- 全人源三培養(yǎng)體系（TCS）模擬了關鍵肝細胞成分及多細胞相互作用，可延長并維持原代人肝細胞（PHH）培養(yǎng)體系的長期存活能力、功能完整性及代謝能力。
- 該體系支持化合物及其代謝產(chǎn)物（如活性代謝產(chǎn)物和結合物）的長期暴露或重復暴露實驗。
- TSC適用于代謝譜分析、低代謝化合物清除率檢測、酶誘導實驗及肝毒性風險評估。
- 拓展了供體來源范圍，可納入來自多數(shù)健康及患病組織（如非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、乙肝相關肝組織）的原代人肝細胞（PHH）批次。
參考文獻
- Khetani SR and Bhatia SN (2008) Microscale culture of human liver cells for drug development. Nat Biotechno/26: 120-126.
- Ukairo 0 et al. (2013) Long -term stabiity of primary rat hepatocytes in micropatterned cocultures. J Biochem Mol Toxico/27: 204-212.
- Ukairo O et a. (2013) Bioactivation and toxicity of acetaminophen in a rat hepatocyte micropatemed coculure system. J Biochem Mol Toxico/27: 471-478
拓展閱讀
- 全人源細胞三培養(yǎng)體系｜形態(tài)、存活時長及功能特性表征
- 全人源肝細胞三培養(yǎng)體系｜CYP450基因誘導潛能表征
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