【Cell】揭秘如何精準開發(fā)激酶激活劑，為心臟疾病帶來新曙光

研究背景：
在藥物研發(fā)領(lǐng)域，激酶抑制劑早已是癌癥治療的核心手段。然而，在心血管疾病、代謝性疾病的治療中，往往需要增強特定的保護性信號通路（如PAK1、AMPK）， 但科學(xué)家們卻長期面臨一個困境：如何開發(fā)激酶激活劑？

近日，由牛津大學(xué)雷鳴教授團隊主導(dǎo)，聯(lián)合來自中國及歐洲多國的研究團隊共同在頂級期刊《Cell》上發(fā)表了一項突破性研究，首次報道了一種小分子PAK1變構(gòu)激活劑。文章不僅揭示了PAK1的“自身抑制釋放”機制，還在肥厚型心肌病模型中證實了顯著的治療效果。更重要的是，提出了一種可推廣的肽引導(dǎo)激酶激活劑發(fā)現(xiàn)策略。

為何激活比抑制更難？

1. 激酶激活劑：一個未被滿足的臨床需求
在人體內(nèi)，激酶是信號通路的“開關(guān)”。抑制劑通過“關(guān)掉”異�；钴S的激酶來治療癌癥，但很多疾�。ㄈ缧牧λソ摺⑻悄虿。┣∏⌒枰�“打開”特定的保護性激酶。然而，開發(fā)激酶激活劑遠比抑制劑困難—因為它需要精準地理解激酶自身的“制動”機制。

2. PAK1：心臟保護的“守門員”
PAK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在心臟中扮演著至關(guān)重要的保護角色。以往研究表明，增強PAK1活性可以對抗病理性心肌肥厚、心力衰竭和心律失常。然而，此前從未有過直接、選擇性的小分子PAK1激活劑問世。

3. 研究的突破口：自身抑制結(jié)構(gòu)域
PAK1在靜息狀態(tài)下處于“自身抑制”狀態(tài)——它的一個激酶抑制片段（類似于“安全插銷”）會插入自身活性口袋，堵住底物和ATP的結(jié)合位點。研究團隊設(shè)想：如果能找到一種分子把這個“插銷”拔出來，就能激活PAK1。

研究方法：如何找到那把“鑰匙”？

1. 肽引導(dǎo)的“鎖”定位
團隊首先從PAK1自身的“激酶抑制片段”中衍生出一個活性肽（PAP）。
原理：PAP就像一把“假插銷”，能競爭性地結(jié)合到抑制片段所在的界面，把原來的“真插銷”擠出去，從而激活PAK1。
作用：利用PAP作為分子探針，通過表面等離子體共振（SPR）和AlphaFold2結(jié)構(gòu)預(yù)測，團隊成功定位了一個此前未被報道的“自身抑制釋放位點”（位于自身抑制結(jié)構(gòu)域與激酶結(jié)構(gòu)域之間），并將其命名為DEK motif。

2. 虛擬篩選與高通量實驗
以DEK motif為靶點，團隊對約200萬個小分子進行了虛擬篩選，結(jié)合RapidFire-MS高通量酶活篩選，初步獲得JB79等激活劑（圖1F）。通過結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR）優(yōu)化，得到活性更強的JB120。

3. 精準“畫像”：光親和標(biāo)記-質(zhì)譜（PAL-MS）
為進一步精確定位結(jié)合位點，團隊合成了帶有光交聯(lián)基團的JB120-PAL探針。通過光親和標(biāo)記-質(zhì)譜技術(shù)，他們鑒定出與激活劑直接結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基（如圖2E所示），最終將結(jié)合口袋精確定位在DEK motif區(qū)域。

4. 從“老藥”中挖掘新用途
基于PAL-MS精確定位的口袋，團隊再次進行虛擬篩選，從FDA批準藥物庫中意外發(fā)現(xiàn)PAK1-A1（艾曲波帕）和PAK1-A2，兩者均能高效激活PAK1（圖3B）。

5. 多維度機制驗證
團隊綜合運用了天然質(zhì)譜（native MS）、FRET生物傳感器、氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）和分子動力學(xué)模擬，從不同角度證實了激活劑結(jié)合后，激酶抑制片段被“推開”，活性口袋暴露，PAK1發(fā)生構(gòu)象變化并啟動自身磷酸化。

研究結(jié)果：從分子到動物的全方位驗證

1. 分子層面：揭示“鋼琴鍵-鎖”模型
團隊首先驗證了PAP的激活效果。通過SPR實驗，他們證實PAP能夠直接結(jié)合全長PAK1。AlphaFold2預(yù)測顯示，PAP結(jié)合在自身抑制結(jié)構(gòu)域與激酶結(jié)構(gòu)域的界面，將內(nèi)源的激酶抑制片段“擠開”�；�于這一發(fā)現(xiàn)，團隊對該界面進行虛擬篩選，獲得首個PAK1激活劑JB79。

圖1 生物活性肽引導(dǎo)的自身抑制釋放位點鑒定

為了明確激活劑的結(jié)合位置，團隊設(shè)計并合成了光親和探針JB120-PAL。通過PAL-MS分析，他們成功鑒定出多個與激活劑直接相互作用的氨基酸殘基，包括Tyr131、Glu315、Val385等，這些殘基恰好位于自身抑制結(jié)構(gòu)域與激酶結(jié)構(gòu)域的界面，進一步驗證了DEK motif是激活劑發(fā)揮作用的“靶心”。

圖2 PAL-MS鑒定PAK1激活劑JB120結(jié)合所依賴的自身抑制釋放位點中的關(guān)鍵殘基

在鎖定靶點后，團隊從FDA批準藥物中篩選出PAK1-A1和PAK1-A2，兩者均能劑量依賴性地激活PAK1。天然質(zhì)譜實驗顯示，PAK1-A1能夠直接結(jié)合PAK1蛋白。

圖3 靶向自身抑制釋放位點以發(fā)現(xiàn)變構(gòu)PAK1激活劑

更重要的是，F(xiàn)RET生物傳感器實驗直觀地展示了激活劑與抑制劑誘導(dǎo)的相反構(gòu)象變化：PAK1-A1處理使PAK1發(fā)生大幅構(gòu)象重排，而抑制劑NVS-PAK1-1則使PAK1維持在“開放”的非活性狀態(tài)。通過定點突變實驗，團隊驗證了關(guān)鍵殘基（如Lys141、Val318、Val385等）對PAK1-A1結(jié)合的重要性。

圖4 激活劑與抑制劑誘導(dǎo)PAK1發(fā)生不同的構(gòu)象變化

氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）結(jié)果顯示，PAK1-A1結(jié)合后，激酶抑制片段區(qū)域的氘交換顯著增加，表明該區(qū)域變得更為動態(tài)、不再被“卡住”。分子動力學(xué)模擬進一步揭示，PAK1-A1結(jié)合后，DFG基序維持在“開”的狀態(tài)。綜合這些數(shù)據(jù)，團隊提出了“鋼琴鍵-鎖”模型：激活劑與抑制劑競爭結(jié)合于DFG基序相鄰的亞口袋，一個“解鎖”激酶，一個將其“鎖死”。

圖5 PAK1激活劑干擾自身抑制機制

2. 細胞層面：精準激活下游信號
為全面評估PAK1-A1的細胞效應(yīng)，團隊對H9C2心肌細胞進行了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示，PAK1-A1處理顯著改變了260多個磷酸化位點，其中MAPK信號通路（尤其是MKK7-JNK分支）被顯著富集。

值得關(guān)注的是，PAK1自身（T229位點）磷酸化水平升高，而PAK2和PAK4的磷酸化未發(fā)生明顯變化，表明PAK1-A1具有良好的亞型選擇性。

通過免疫印跡實驗，團隊進一步確認PAK1-A1和PAK1-A2能夠時間依賴性地增強PAK1自身磷酸化，并激活其下游底物Merlin，驗證了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)現(xiàn)。

體外激酶活性實驗表明，PAK1-A1能夠選擇性激活PAK1，而對PAK2、PAK3無明顯激活作用，這一結(jié)果在獨立的放射性激酶實驗中得到進一步證實，確保了化合物的特異性。

圖6 PAK1激活劑在細胞中刺激PAK1依賴性信號傳導(dǎo)

3. 動物模型：逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，展現(xiàn)治療潛力
在異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的體外心肌細胞肥大模型中，PAK1-A1和PAK1-A2處理顯著抑制了心肌細胞的增大，同時降低了肥大標(biāo)志物ANP和BNP的表達水平。更重要的是，當(dāng)化合物在肥大已建立后再給藥時，仍然能夠逆轉(zhuǎn)已存在的細胞肥大，展現(xiàn)了治療而非單純預(yù)防的潛力。

在血管緊張素II（Ang II）誘導(dǎo)的小鼠心臟肥厚模型中，皮下輸注PAP能有效減輕心臟質(zhì)量增加和室壁增厚。

團隊還在多種模型中驗證了治療效應(yīng)：

心肌細胞特異性PAK1敲除小鼠（PAK1 cko）：PAP的心臟保護作用在PAK1敲除小鼠中消失，明確了效應(yīng)的靶向性。

橫主動脈縮窄（TAC）模型：JB79治療同樣改善了心臟功能、減輕了肥厚和纖維化。

E99K HCM小鼠模型（模擬人類肥厚型心肌�。�：PAK1-A2口服治療顯著改善心功能、減輕室壁厚度，并抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress）標(biāo)志物的表達，揭示了潛在的分子機制。

圖7 PAK1激活劑在細胞和小鼠心肌肥厚模型中顯示出治療效果

圖S7 PAP、JB79和PAK1-A2在心肌肥厚模型中的治療效果評估

4. 策略普適性驗證：從PAK1到PKA
為驗證該策略是否適用于其他激酶，團隊將其應(yīng)用于蛋白激酶A（PKA）。他們從PKA的抑制性亞基RⅠα中設(shè)計出激活肽，通過虛擬篩選成功鑒定出PKA變構(gòu)激活劑Cpd1和Cpd2。

FRET實驗證實，這些化合物在細胞中能夠有效激活PKA。這一結(jié)果證明，“肽引導(dǎo)的自身抑制釋放位點篩選策略”具有可推廣性。

圖S6 激活劑誘導(dǎo)的下游PAK1信號傳導(dǎo)及靶向類似自身抑制釋放位點的PKA激活劑的概念驗證鑒定，與圖6相關(guān)

一個策略，一條新路

1. 首次實現(xiàn)PAK1直接、選擇性小分子激活
該研究成功開發(fā)了首個直接靶向PAK1的小分子變構(gòu)激活劑，填補了該領(lǐng)域的重要空白。

2. 提出可推廣的激酶激活劑發(fā)現(xiàn)策略
通過“肽引導(dǎo)→定位自身抑制釋放位點→虛擬篩選→結(jié)構(gòu)優(yōu)化”的理性設(shè)計流程，為其他激酶激活劑的研發(fā)提供了全新范式。

3. 驗證激酶激活劑在心血管疾病中的治療潛力
在多種心肌肥厚模型中，PAK1激活劑展現(xiàn)出預(yù)防與治療雙重效果，為臨床上缺乏有效治療手段的肥厚型心肌病（HCM）提供了新的藥物候選。

4. 深化對激酶調(diào)控機制的理解
提出的“鋼琴鍵-鎖”模型，揭示了同一調(diào)控界面如何通過細微差異實現(xiàn)“激活”與“抑制”的切換，為未來設(shè)計更精準的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑提供了理論指導(dǎo)。

長期以來，激酶激活劑的研發(fā)被視為“硬骨頭”。這項研究不僅啃下了這塊骨頭，更重要的是總結(jié)出了一套可復(fù)制的方法論。從PAK1到PKA，從肽探針到小分子，從分子機制到動物療效，這項研究為“如何理性設(shè)計激酶激活劑”交出了一份近乎完美的答卷。

隨著這一策略的推廣，我們有理由期待，未來將有更多針對心力衰竭、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病等領(lǐng)域的激酶激活劑問世，為那些“需要被激活”的疾病帶來新的治療希望。