2026年3月，一項發(fā)表于《自然通訊》（Nature Communications）的研究，為解決超分辨率熒光成像中長期存在的技術瓶頸提供了一個全新的通用型蛋白標記系統(tǒng)。這項研究開發(fā)了名為FLEXTAG（Fluorescent Labeling for Exchangeable, X-resilient Tagging in Advanced Generic Nanoscopy）的框架，其核心是三個彼此正交、尺寸超小（12-18 kDa）且具有“自我更新”能力的蛋白標簽。該系統(tǒng)通過有機熒光染料的持續(xù)交換，顯著緩解了光漂白問題，并兼容包括SIM（結構光照明顯微鏡）、STED（受激發(fā)射損耗顯微鏡）、STORM（隨機光學重建顯微鏡）和PAINT（點積累成像納米拓撲術）在內(nèi)的主流超分辨成像模式。尤為重要的是，研究團隊還創(chuàng)新性地開發(fā)了“保護性固定”方法與化學封閉策略，有效克服了化學固定導致的標記效率下降和非特異性熒光背景問題，實現(xiàn)了在活細胞和固定細胞中均能進行高質(zhì)量、抗光漂白的多色超分辨成像。

這項重要工作的主要完成者包括Han Zhang, Yuan Yao, Xuye Wang, Yuanmin Zheng, Shaoqing Zhang, Yuan Tao, Haopeng Yang, Yinqi Wang, Mengde Liu, Marina Feric 和 Ruobo Zhou。他們共同完成的論文《FLEXTAG: a small and self-renewable protein labeling system for anti-fading multi-color super-resolution imaging》于2026年3月在線發(fā)表。

重要發(fā)現(xiàn)
本研究系統(tǒng)性地開發(fā)并驗證了FLEXTAG蛋白標記系統(tǒng)，旨在克服當前超分辨成像中蛋白標簽技術的四大主要局限：快速光漂白、標簽誘導的蛋白錯誤定位與聚集假象、固定后標記效率低下以及有限的多色復用能力。FLEXTAG通過整合三個精心工程化改造的小尺寸自我更新標簽、一套保護性固定方案以及優(yōu)化的封閉策略，為長時程、多色、納米精度的細胞成像提供了一個“一站式”解決方案。

FLEXTAG1的開發(fā)：其前體來源于人源蛋白BRD4的第二溴結構域（BRD4BD2）的一個突變體（L55A），原本用于靶向蛋白降解。研究首先證實其配體ET-JQ1在成像條件下對細胞內(nèi)源性溴結構域蛋白的結合可忽略不計。隨后，為克服該蛋白強烈的二聚化傾向導致的標記蛋白聚集問題，團隊利用ColabFold人工智能工具預測其二聚界面，并引入關鍵點突變（H105A, M120G）以破壞二聚化。最終獲得的突變體BRD4BD2L55A, H105A, M120G在保持高標記效率的同時，極大地減少了聚集，被確立為FLEXTAG1。即使在后續(xù)保護性固定所需的高濃度配體存在下，也未誘發(fā)顯著聚集。

FLEXTAG2的開發(fā)：以前人大腸桿菌二氫葉酸還原酶（eDHFR）的非共價標簽系統(tǒng)為基礎。為提高其相對較低的標記效率，研究者假設eDHFR固有的結構不穩(wěn)定性是原因之一。他們通過引入能夠形成分子內(nèi)二硫鍵的突變（P89C）并在N端添加一段多甘氨酸連接子（C(G)5），設計出了C(G)5-eDHFRP89C變體。該變體通過穩(wěn)定蛋白構象，將標記效率提升了約3.3倍，同時保持了單體狀態(tài)和快速配體交換動力學，非常適合PAINT成像，因此被命名為FLEXTAG2。

FLEXTAG3的開發(fā)：基于人源FKBP蛋白的F36V突變體。盡管其配體SLF’結合親和力極高，但交換動力學過慢，不利于自我更新。為此，團隊篩選了配體結合口袋附近的一系列單點突變，發(fā)現(xiàn)I91A突變（FKBPF36V, I91A）能在維持足夠標記亮度的同時，顯著加快配體交換速率，從而使其兼容PAINT成像。該變體被確定為FLEXTAG3。雖然其仍存在約20%的輕微二聚化傾向，但處于可接受范圍。

保護性固定方法：為解決標記效率下降，團隊提出了“保護性固定”策略。在固定前，用高濃度、無熒光的FLEXTAG配體（如ET-JQ1、TMP、SLF’）預處理活細胞，使其預先占據(jù)標簽的結合口袋。隨后，在固定液中也包含這些配體的情況下進行固定。這種方法能有效“鎖住”標簽的配體結合構象，屏蔽交聯(lián)反應，從而在固定后大幅保留標簽的可及性。實驗表明，此方法能將固定后標簽的標記效率恢復至活細胞水平的49.7%到72.2%，較傳統(tǒng)固定有3.1到8.8倍的提升。

兼容SMLM技術（PAINT, STORM）：FLEXTAG配體與標簽的動態(tài)、可逆結合本質(zhì)上是PAINT成像的理想機制。研究展示了所有三個FLEXTAG標簽在2D和3D PAINT成像中的優(yōu)異表現(xiàn)，并實現(xiàn)了與phalloidin-PAINT探針結合的三色成像。在更具挑戰(zhàn)的活細胞STORM成像中，團隊將FLEXTAG3與光開關染料HMSiR結合。在長達4.5分鐘的連續(xù)成像中，F(xiàn)LEXTAG3保持了96.6%的單分子定位點，而對照的非更新型HaloTag信號衰減超過70%。這證明了FLEXTAG-STORM能夠支持對線粒體動力學等過程的長時間、高分辨率活細胞觀測。

FLEXTAG是一個集小型化、最小聚集性、自我更新能力和高度正交性于一體的綜合性蛋白標記框架。它成功克服了現(xiàn)有標簽系統(tǒng)在光穩(wěn)定性、標記準確性、固定細胞兼容性和多色能力方面的關鍵限制，為在活細胞和固定細胞中進行長期、多色、納米精度的超分辨率成像研究提供了一個強大而通用的工具。

創(chuàng)新與亮點
本研究最主要的創(chuàng)新在于系統(tǒng)性地攻克了超分辨成像蛋白標記領域的多個長期痛點。首先，它創(chuàng)造了目前性能最均衡的自我更新蛋白標簽：相比已有的dHaloTag，F(xiàn)LEXTAG尺寸小一半（<20 kDa），更少引起蛋白錯誤定位；相比基于熒光蛋白發(fā)色團的pFAST等標簽，F(xiàn)LEXTAG兼容更亮、更多樣化的有機染料，光穩(wěn)定性和亮度顯著提升。其次，它創(chuàng)新性地提出了“保護性固定”方案，首次有效解決了自我更新標簽在固定細胞中標記效率驟降的難題，將此技術的應用范圍從活細胞拓展至固定樣本，為連接動態(tài)成像與超微結構分析（如關聯(lián)光鏡電鏡）鋪平了道路。第三，它展現(xiàn)了真正的“一標多用”通用性，同一套FLEXTAG標記的樣本，可根據(jù)分辨率、速度等不同需求，無縫切換至SIM、STED、PAINT或STORM等不同原理的超分辨顯微鏡進行成像，極大提升了實驗靈活性。

總結與展望
總而言之，F(xiàn)LEXTAG通過集成三個小型化、自更新的正交蛋白標簽，輔以創(chuàng)新的樣品制備方法，構建了一個強大而通用的超分辨成像標記框架，顯著推進了納米尺度生命過程可視化能力。展望未來，該系統(tǒng)的應用潛力巨大。一方面，可進一步探索其在關聯(lián)光鏡-電鏡（CLEM）中的價值，將FLEXTAG揭示的蛋白動態(tài)信息與電鏡提供的超微結構上下文精準整合。另一方面，其小型化和高保真的特性使其非常適合用于標記內(nèi)源基因位點，結合CRISPR等技術，有望在更接近生理的條件下研究內(nèi)源蛋白的行為。此外，繼續(xù)開發(fā)光譜范圍更廣、亮度更高、交換動力學更優(yōu)的新型配體-染料組合，將進一步提升FLEXTAG在深度多色成像和高速動態(tài)觀測中的性能邊界。

DOI:10.1038/s41467-026-69658-9.