磷酸化蛋白做WB小妙招

1、一定要在Lysis Buffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑；

2、加一抗后最好4度過(guò)夜，保證抗體有充分的結(jié)合時(shí)間，因?yàn)榱姿峄�的蛋白只占總蛋白量的極少部分；

3、選擇優(yōu)質(zhì)的磷酸化抗體，所以要選好的廠商，Novus為全球高端抗體品牌，其磷酸化抗體效果不錯(cuò)；

4、抗體的稀釋倍數(shù)要優(yōu)化，可以根據(jù)廠商建議進(jìn)行優(yōu)化；

5、用含5% BSA的TBST稀釋抗體，不要用常見(jiàn)的5% -Fat Milk的TBST；

6、磷酸化蛋白WB時(shí)背景也往往較深,所以壓片時(shí)間要適當(dāng),不能太長(zhǎng)或過(guò)短,太長(zhǎng)則背景太深蓋住想要的那條條帶，時(shí)間過(guò)短則可能沒(méi)有條帶或者條帶太淺；

7、磷酸化蛋白WB時(shí),用TBST洗時(shí)也要注意一下,搖床的轉(zhuǎn)速不要太快,洗的時(shí)間不要太長(zhǎng),孵育一抗和二抗之后分別洗5min 3次即可,寧愿背景深一些,總比做不出來(lái)強(qiáng)得多.另外，洗的時(shí)候，最好不要把幾張膜疊在一起洗。 
 
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