1、在每個流式上樣管中加入100 µl準備好的細胞懸液，細胞數約為1x106個.

2、按照細胞表面抗原染色方法標記表面抗原。根據說明書加入CD4和CD25抗體100 µl體系中使用0.125 µg FITC anti-mouse CD4，0.06 µg APC anti-mouse CD25抗體。最好根據這些試劑詳細的說明書操作。4 ℃孵育30 分鐘。孵育表面抗體之前加入Fc受體阻斷劑。 

3、用預冷流式染色緩沖溶液洗滌細胞（離心并轉移）。

4、旋渦震蕩重懸細胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3稀釋好），并再次旋渦混勻。

5、避光4℃孵育30分鐘到18小時（孵育30分鐘到18小時，結果一樣）。

6、加入2ml 破膜緩沖液（Permeabilization Buffer）（1:9去離子水稀釋）離心洗滌細胞并棄去上清液。

7、重復第6步操作洗滌細胞。

8、（可選）加入含0.5 µg Fc受體阻斷劑的破膜緩沖液，保證100 µl體系4 ℃孵育15分鐘。

9、封閉液無需洗去，體系加入0.5 µg PE anti­mouse/rat Foxp3抗體和PE Rat lgG2a同型對照（用Permeabilization Buffer工作液進行稀釋），避光4℃孵育至少30分鐘。建議進行預實驗摸索出抗體的最適濃度。

10、加入2ml破膜工作液離心洗滌細胞并棄去上清液。

11、重復上一步洗滌細胞。

用適量體積的Flow Cytometry Staining Buffer重懸細胞，并上機檢測并分析。注：由于染色過程中使用了細胞固定和破膜，對比起活細胞在形態(tài)上會有一定變化，因此FSC/SSC圖中圈門時需要做一定調整。 

以上步驟僅供參考，以廠家說明書為準。