文章來源公眾號：生物快評           作者：sw

David Baker，2024諾貝爾化學獎的主，華盛頓大學教授

2025年9月29日David Baker，2024諾貝爾化學獎得主發(fā)表了一篇《Computational design of pH-sensitive binders》，這篇文章利用對Binder的結合界面增加組氨酸來讓其具有pH的敏感性。

氨基酸的結構上，一端為氨基NH2，一端為COOH基團，中間為一個CH，其中CH上為側鏈基團，R基團的差異就會導致氨基酸性質的改變。那么根據(jù)R基團的差異，可以將氨基酸分成4類：非極性氨基酸（就是不電離，不親水的氨基酸）；極性氨基酸（就是不帶電，但是親水的氨基酸）；堿性氨基酸（即在中性pH下帶正電的氨基酸）；酸性氨基酸（即在中性pH下帶負電的氨基酸）。

20種氨基酸分類表（4大類）

Ka 是這個解離反應的平衡常數(shù)，其表達式為：

其中，[ ] 表示濃度。pKa值越小，酸性越強；pKa值越大，酸性越弱。

pKa 是Ka 的負常用對數(shù)：

氨基酸的電解，比如每個氨基酸都有電解常數(shù)1pKa1（COOH電解釋放H+的能力），NH2基團的電解常數(shù)pKa2(即NH2釋放H+的能力)。其中有7個氨基酸的R基團也能夠電離，所以他們額外有了pK_R（即R基團電離釋放H+的能力）。

這7個氨基酸即3個堿性氨基酸Lysine\Argine\Histidine，2個酸性氨基酸aspartic acid和glutamic acid。

以及1個親水性的Cysteine，因為其側鏈含有巰基（R-SH），該基團在堿性環(huán)境中可作為質子供體，失去質子后形成硫醇陰離子（R-S⁻）；一個疏水性的Tyrosine（酪氨酸的酚羥基可發(fā)生去質子化，該化學特性與苯酚（由苯環(huán)和氧原子構成）類似，固有pKr）。

在低pH（酸性）環(huán)境中，溶液中的H⁺濃度高，會抑制羧基的解離，并促使氨基結合H⁺。因此，氨基酸整體帶正電荷。

在高pH（堿性）環(huán)境中，溶液中的OH⁻會中和H⁺，促使羧基解離釋放H⁺，同時氨基也難以結合H⁺。因此，氨基酸整體帶負電荷。

隨著pH值從低到高變化，氨基酸的凈電荷會從正電荷逐漸變?yōu)樨撾姾�。在這個變化過程中，必然存在一個特定的pH值，使得氨基酸的正負電荷數(shù)恰好相等，凈電荷為零。這個pH值就是該氨基酸的等電點（pI）。

如下圖給出了20個氨基酸的pKa和pI值。

pH和一些細胞內吞過程有關系，比如新生兒Fc受體，FcRn

Biopolymers. 2017 Dec 21. doi: 10.1002/bip.23095.

新生兒Fc受體，是一種在整個生命體內都發(fā)揮重要作用的蛋白質。它最初是在新生兒腸道中被發(fā)現(xiàn)的，負責吸收母體乳汁中的抗體（IgG），因此得名。FcRn的核心功能是延長抗體（IgG）和白蛋白在體內的壽命。其工作機制非常獨特，依賴于pH值的差異：

血液中的抗體（IgG）和白蛋白會被細胞通過“胞飲”作用隨機地吞進細胞內，形成名為“內體”的小泡。內體內的環(huán)境是酸性的（pH約6.0-6.5）。酸性環(huán)境下結合：在酸性條件下，F(xiàn)cRn受體的結構會發(fā)生改變，使其能夠與IgG或白蛋白的Fc段（恒定區(qū)）高親和力地結合。可以理解為，在酸性“房間”里，F(xiàn)cRn能“認出”并“抓住”這些有用的分子。循環(huán)與釋放：沒有被FcRn結合的其它蛋白質會被運送到溶酶體中進行降解。而被FcRn“抓住”的IgG和白蛋白則會被安全地運輸回細胞表面。中性環(huán)境下釋放：當這個載有FcRn和其“貨物”的小泡回到細胞表面時，會遇到血液中性的環(huán)境（pH約7.4）。在這個條件下，F(xiàn)cRn與IgG/白蛋白的親和力急劇下降，于是釋放它們回血液中。過程重復：這個循環(huán)過程周而復始，使得IgG和白蛋白在體內的半衰期（存活時間）非常長（IgG的半衰期約為21天）。

蛋白設計的目標，在蛋白質靶向降解的情況下，比如溶酶體靶向降解（Lysosome targeting chimeras (LYTACs)，需要一個binder，一端結合目標待降解分子，另一端靶向溶酶體循環(huán)受體（lysosome trafficking receptor (LTR)），這樣binder同時靶向LTR和目標分子后，則會通過LTR內吞進入溶酶體將目標分子降解。傳統(tǒng)的這類LYTAC技術沒有考慮在lysosome中與目標分子的解離，導致了這類LYTAC binder分子在lysosome中也一同和目標分子一起水解，這樣導致了LYTAC binder的使用量需要增加。

所以作者就想能不能設計一個LYTAC binder，和目標分子在中性pH下結合能力強，在酸性pH環(huán)境下結合能力下降而與目標分子解離。

那么怎么做到呢？

需要增加一些在pH酸性環(huán)境下，Binder的結合能力下降或者Binder自身的結構改變了。組氨酸是唯一側鏈pKa值接近中性pH（~7.64）的氨基酸殘基，這使得它對生物體內的pH梯度變化尤為敏感。循環(huán)系統(tǒng)中的pH值約為7.4，內吞體中為5.0-6.0，而腫瘤微環(huán)境（TME）中為6.0-6.5。根據(jù)其質子化狀態(tài)的不同，組氨酸既能接受也能提供與帶電殘基之間的氫鍵。當環(huán)境pH低于其pKa值（約6.5）時，質子化的組氨酸可作為兩個氫鍵的供體而非受體；而當環(huán)境pH高于pKa值時，去質子化的組氨酸既能作為一個氫鍵的供體，又能作為另一個氫鍵的受體——這第二個氫鍵在轉移至pH6的酸性環(huán)境時會被破壞。

作者首先整體隨機增加binder的His的比例，發(fā)現(xiàn)并沒有效果。隨后作者按照兩種思路進行實驗：思路1是在binder與目標分子結合的表面增加His，比如His在pH中性環(huán)境不影響binder結合目標分子，而pH酸性條件下，His攜帶H+而影響了對目標分子的結合，從而達到解離的效果（即interface destablization）。另一個思路就是在binder的內部增加His，在酸性pH環(huán)境下binder中His攜帶同電荷的H+而排斥作用從而達到了與目標分子的解離作用，這個思路的局限是需要這樣的binder分子較大，否則His會提前暴露。

比如靶向EpA2的binder，經過interface destablization后，在pH=7.4下KD為678pM, 而在pH=5.4下，KD為15nM。所以EphA2 binder在酸性環(huán)境下親和力下降~20倍。

效果上，顯示pH-LYTAC在相同的劑量下可以靶向降解目標分子EphA2的能力顯著增強（~90%降解），而常規(guī)LYTAC技術降解目標分子效率只有~50%，原因在與pH-LYTAC可以循環(huán)利用。

這篇文章的核心生化原理并不復雜，難度是在于將His“裝飾”在binder的結合表面等，怎么保持不改變binder對目標分子在pH=7.4下的結合能力。因為我們知道這種binder的“結合表面”改動一個氨基酸都有可能改變binder的結合能力，甚至無法結合或者產生脫靶向能力。David baker實驗室首先通過計算等辦法找到結合的表面或者binder的核心，然后通過噬菌體展示技術進行篩選確定有效的binder。

作者David Baker為2024年諾獎得主，其實其導師，和導師的導師均獲得了諾獎。見下：

David Baker于2024年因開發(fā)蛋白質折疊RossetaFold榮獲諾貝爾化學獎。

Randy Wayne Schekman是David baker的博士生導師，博士期間研究DNA聚合酶，個人獨立研究為囊泡運輸，2013年謝克曼與詹姆斯·羅思曼和托馬斯·聚德霍夫因為在細胞膜囊泡運輸方面有開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)而共同獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

Randy Wayne Schekman的博士生導師是Arthur Kornberg(1918年3月3日—2007年10月26日），他研究研究DNA聚合酶而于1959年的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。