Mechanical stress facilitates calcium influx and growth of alveolar epithelial cells via activation of the BDKRB1/Ca2+/CaMKII/MEK1/ERK axis

Keywords: Alveolar epithelial cells, Mechanical stress, Calcium, Growth, Bradykinin receptor B1

肺部在呼吸過程中持續(xù)承受機械力，這種機械應(yīng)力通過細(xì)胞外基質(zhì)影響細(xì)胞 - 基質(zhì)相互作用，對肺組織細(xì)胞功能及機械穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)至關(guān)重要。但非生理性機械負(fù)荷可引發(fā)多種肺部疾病，而多種細(xì)胞內(nèi)信號通路參與這些過程中的生理穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，因此闡明機械應(yīng)力相關(guān)分子機制對改善肺功能和促進肺組織網(wǎng)絡(luò)重塑意義重大。

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BDKRB1 作為 G 蛋白偶聯(lián)受體，參與多種生理病理過程，其表達(dá)變化與肺發(fā)育及肺部疾病相關(guān)，且能調(diào)節(jié)鈣代謝。鑒于鈣代謝在機械應(yīng)力誘導(dǎo)的肺組織網(wǎng)絡(luò)重塑中的重要性，推測機械應(yīng)力可能通過 BDKRB1 介導(dǎo)的信號通路在肺發(fā)育過程中調(diào)控鈣代謝。

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基于此，昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科的研究團隊通過對肺泡上皮細(xì)胞施加機械應(yīng)力來研究該應(yīng)力對 BDKRB1 表達(dá)的影響，并闡明機械應(yīng)力與 BDKRB1 在調(diào)節(jié)鈣代謝中的作用。研究成果發(fā)表在 Respiratory Research  期刊，題為“Mechanical stress facilitates calcium influx and growth of alveolar epithelial cells via activation of the BDKRB1/Ca2+/CaMKII/MEK1/ERK axis”。

首先，研究人員通過 CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、EdU 染色等實驗，分析不同振幅（5%、10%、15%）機械應(yīng)力對肺泡上皮細(xì)胞（ RLE-6TN ）生長及鈣穩(wěn)態(tài)的影響。

CCK-8 實驗結(jié)果顯示，施加 5% 機械應(yīng)力 6、12、24 小時后，RLE-6TN 細(xì)胞活力未受顯著影響（圖 1A，P>0.05）；而 10% 機械應(yīng)力處理 12、24 小時可顯著提高細(xì)胞活力，15% 振幅的機械應(yīng)力則會顯著降低細(xì)胞活力（圖 1A，P<0.05）。 rle-6tn="" g2="" p="">0.05）；且 5% 振幅處理 6、12、24 小時后，細(xì)胞在 G1 期、S 期、G2 期的分布未發(fā)生顯著改變（圖 1B，P>0.05）。但 10% 振幅處理 6、12 小時會使 G1 期細(xì)胞比例降低、S 期細(xì)胞比例升高（圖 1B，P<0.05）；相反，15% 振幅處理 12、24 小時會導(dǎo)致 G1 期細(xì)胞比例升高、S 期細(xì)胞比例降低（圖 1B，P<0.05）。

圖1   機械應(yīng)力對 RLE-6TN 細(xì)胞活力及細(xì)胞周期的影響 。

接著，研究人員通過 EdU 染色評估機械應(yīng)力對細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)，10% 機械應(yīng)力在所有時間點均能顯著提高 EdU 陽性率，15% 機械應(yīng)力則會顯著降低該陽性率（圖 2，P<0.05）。這些結(jié)果提示，10% 機械應(yīng)力可促進 RLE-6TN 細(xì)胞生長，15% 機械應(yīng)力則抑制細(xì)胞增殖。

圖 2    機械應(yīng)力對 RLE-6TN 細(xì)胞增殖的影響。

在鈣內(nèi)流方面，任何振幅的機械應(yīng)力處理 6 小時，均未顯著改變 Fluo-3 + 細(xì)胞比例（圖 3，P>0.05）；而處理 12、24 小時后，F(xiàn)luo-3 + 細(xì)胞比例顯著升高（圖 3，P<0.05），表明機械應(yīng)力可增強細(xì)胞的鈣內(nèi)流。

圖 3 機械應(yīng)力對 RLE-6TN 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

已證實 BDKRB1 與 CaMKIIα/δ 均與鈣代謝相關(guān)。因此，研究人員進一步探究了不同振幅的機械應(yīng)力對肺泡上皮細(xì)胞中 BDKRB1 與 CaMKIIα/δ 表達(dá)的影響。 RT-qPCR 分析顯示 ，10% 和 15% 機械應(yīng)力可上調(diào) BDKRB1 與 CaMKIIα/δ 的 mRNA 表達(dá)（圖 4A，P<0.05），5% p="">0.05 ）。這些結(jié)果提示，機械應(yīng)力可能通過上調(diào) BDKRB1 與 CaMKIIα/δ 的表達(dá)，誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生鈣內(nèi)流。

 圖4 機械應(yīng)力對RLE-6TN細(xì)胞中BDKRB1/Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK軸的影響。

已知鈣代謝可調(diào)控細(xì)胞生長，且該過程與 MEK1/ERK 通路相關(guān) 。因此，研究人員進一步觀察了 RLE-6TN 細(xì)胞中 MEK1/ERK 通路的活性變化。結(jié)果顯示，15% 機械應(yīng)力處理 12、24 小時后，MEK1、ERK1 與 ERK2 的 mRNA 水平顯著降低（圖4B，P<0.05），而其他振幅的機械應(yīng)力對此無顯著影響（圖 p="">0.05）。在蛋白水平，10% 機械應(yīng)力處理 12 小時（既促生長又促鈣內(nèi)流的條件）可上調(diào)軸中關(guān)鍵分子（BDKRB1、CaMKIIα/δ）及通路磷酸化蛋白（p-MEK1、p-ERK1/2）的表達(dá)（圖 4C、D，P<0.05） 。這些結(jié)果表明，10% 機械應(yīng)力可激活 BDKRB1/Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK 軸，這可能是其促進 RLE-6TN 細(xì)胞生長與鈣內(nèi)流的重要機制。

接下來，為了驗證 10% 機械應(yīng)力的作用是否通過 BDKRB1/Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK 軸介導(dǎo)，研究人員采用慢病毒介導(dǎo)的 RNA 干擾技術(shù)敲低 RLE-6TN 細(xì)胞中 BDKRB1 的表達(dá)。先篩選出敲低效率最高的 Lv-BDKRB1 #3 載體，使 BDKRB1 的 mRNA 水平降低（圖 5A）。對比各組實驗發(fā)現(xiàn)，10% 機械應(yīng)力能顯著促進細(xì)胞生長相關(guān)指標(biāo)（活力、S 期比例、EdU 陽性率）和鈣內(nèi)流，而陰性對照無影響（圖 5B-E）。但 BDKRB1 敲低后，上述受 10% 機械應(yīng)力促進的指標(biāo)均顯著下降，G1 期細(xì)胞比例升高（圖 5B-E）。這些結(jié)果表明， BDKRB1 是 10% 機械應(yīng)力發(fā)揮促生長、促鈣內(nèi)流作用的關(guān)鍵介導(dǎo)分子。  

圖 5    BDKRB1 敲低對機械應(yīng)力介導(dǎo)的 RLE-6TN 細(xì)胞生長及鈣內(nèi)流的影響。

最后，研究人員進一步探究了抑制 BDKRB1 對 10% 機械應(yīng)力介導(dǎo)的 BDKRB1/Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK 軸的影響。結(jié)果顯示，10% 機械應(yīng)力可顯著提高 RLE-6TN 細(xì)胞中 BDKRB1、CaMKIIα/δ、p-MEK1及 p-ERK1/2 的水平，但不影響 MEK1 和 ERK1/2 的 mRNA 或蛋白表達(dá)（圖 6A-D，P>0.05），陰性對照無顯著影響（圖 6A-D，P>0.05）。而BDKRB1 敲低能顯著降低 BDKRB1、CaMKIIα/δ 的 mRNA （圖 6A）和蛋白水平（圖 6C ），以及 p-MEK1、p-ERK1/2 的水平，但對總 MEK1 和 ERK1/2 的表達(dá)無顯著影響（圖 6B、6D，P > 0.05）。這些結(jié)果表明，BDKRB1 抑制可削弱 10% 機械應(yīng)力對 RLE-6TN 細(xì)胞中 Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK 軸的刺激作用。

圖 6 BDKRB1 敲低對機械應(yīng)力介導(dǎo)的 RLE-6TN 細(xì)胞中 Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK 軸的影響。

圖7   機械應(yīng)力相關(guān)信號機制。

總之，該研究表明， 10% 幅度的機械應(yīng)力可通過上調(diào) BDKRB1 表達(dá)促進鈣內(nèi)流，進而激活 CaMKII/MEK1/ERK 信號通路，最終促進 RLE-6TN 細(xì)胞生長（圖 7）。該研究揭示了鈣代謝相關(guān)的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，為理解和治療機械應(yīng)力相關(guān)肺部疾病提供了理論依據(jù)。

參考文獻：Zhang Y, Zhang QD, Li Q, Shi ZY, Pan C, Yan RS, Fei DR, Xu SX, Luo Y. Mechanical stress facilitates calcium influx and growth of alveolar epithelial cells via activation of the BDKRB1/Ca2+/CaMKII/MEK1/ERK axis. Respir Res. 2025 Apr 28;26(1):168. doi: 10.1186/s12931-025-03240-7. PMID: 40296124; PMCID: PMC12038983.
原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12038983/

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