摘要     
顯微CT在生物軟組織成像中常面臨對比度不足的問題，臨界點干燥是提升圖像質(zhì)量的關(guān)鍵前處理步驟。本文系統(tǒng)介紹該技術(shù)的操作流程，并結(jié)合昆蟲肌肉、腦部及幼蟲器官三大案例，為相關(guān)領(lǐng)域研究者提供可復(fù)用的實驗方案。
   
顯微CT成像的挑戰(zhàn)與突破     
傳統(tǒng)的顯微CT成像對骨骼、牙齒等高密度結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出色，但對于軟組織結(jié)構(gòu)，由于低原子序數(shù)元素的弱吸收特性，成像對比度常不理想。臨界點干燥技術(shù)通過溫和去除樣本中的液體，最大程度減少組織收縮與變形，顯著提升信噪比，是獲取高質(zhì)量三維重建數(shù)據(jù)的必備步驟。
 
三大案例展示臨界點干燥的實際應(yīng)用         
案例一：書蝎肌肉系統(tǒng)顯微CT成像方法                     
樣本類型      

• 物種：書蝎（Neobisium sp.）    
• 目標：肌肉系統(tǒng)三維結(jié)構(gòu)可視化  Courtesy of Elisabeth Lipke and Dr. Peter Michalik, University of Greifswald, Germany.                

推薦標準化實驗流程 （基于Leica EM CPD300）     
1、樣本裝載      

• 使用微孔樣本罐，置于“濾片與多孔罐支架”中。   

2、固定與脫水      

• 70% 乙醇中固定，過夜    
•      乙醇梯度脫水：

1. 80% 乙醇，10分鐘
2. ✫ 90% 乙醇，10分鐘
3. ✫ 96% 乙醇，10分鐘
4. ✫ 100% 乙醇，2次，每次10分鐘   

3、染色      

• 使用1% 碘乙醇溶液（溶于100%乙醇）過夜染色    
• 100% 乙醇沖洗2次，每次10分鐘   

4、臨界點干燥      

• 使用Leica EM CPD300全自動程序處理     

5、掃描      

• 干燥樣本粘附于樣品臺上    
• 使用X射線顯微CT系統(tǒng)掃描       

案例二：蒼蠅腦部神經(jīng)結(jié)構(gòu)顯微CT成像方法                     
樣本類型      
物種：綠頭蒼蠅（Lucilia caesar）    
目標：腦部神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)三維重建 Courtesy of Elisabeth Lipke and Dr. Peter Michalik, University of Greifswald, Germany.               

推薦標準化實驗流程 （基于Leica EM CPD300）     
1、樣本裝載      

• 樣本單獨放置于“節(jié)肢動物支架”的腔室中。   

2、固定與脫水      

• Bouin固定液過夜固定    
• 0.1 M磷酸緩沖液（含1.8%蔗糖，pH 7.2）沖洗3次，每次10分鐘    
• 乙醇梯度脫水：

1. ✫ 60%、70%、80%、90%、96%、100%乙醇，每步10分鐘
2. ✫ 100%乙醇重復(fù)2次   

3、染色      

• 1% 碘乙醇溶液過夜染色    
• 100% 乙醇沖洗2次，每次10分鐘   

4、臨界點干燥      

• 使用Leica EM CPD300全自動程序處理     

5、掃描      

• 干燥樣本粘附于樣品臺上    
• 使用X射線顯微CT系統(tǒng)進行高分辨率掃描       

案例三：紅血蟲幼蟲器官系統(tǒng)顯微CT成像方法                     
樣本類型      

• 物種：搖蚊幼蟲（紅血蟲）    
• 目標：幼蟲內(nèi)部器官系統(tǒng)三維重建 Courtesy of Elisabeth Lipke and Dr. Peter Michalik, University of Greifswald, Germany. 

推薦標準化實驗流程 （基于Leica EM CPD300）     
1、樣本裝載      

• 樣本單獨放置于“節(jié)肢動物支架”腔室中。   

2、固定與脫水      

• 2.5% 戊二醛（溶于0.1 M磷酸緩沖液）過夜固定    
• 0.1 M磷酸緩沖液（含1.8%蔗糖，pH 7.2）沖洗3次，每次10分鐘    
• 乙醇梯度脫水：

1. ✫ 60%、70%、80%、90%、96%、100%乙醇，每步10分鐘
2. ✫ 100%乙醇重復(fù)2次   

3、染色      

• 1% 碘乙醇溶液過夜染色    
• 100% 乙醇沖洗2次，每次10分鐘   

4、臨界點干燥      

•  使用Leica EM CPD300全自動程序處理   

5、掃描      

• 干燥樣本粘附于樣品臺上    
• 使用X射線顯微CT系統(tǒng)掃描    

技術(shù)總結(jié)        
以上三種方法均采用：  

• 標準化乙醇梯度脫水    
• 碘乙醇染色增強對比    
• Leica EM CPD300全自動干燥    
• 顯微CT系統(tǒng)掃描   

流程可根據(jù)樣本硬度、大小與結(jié)構(gòu)復(fù)雜度進行微調(diào)，適用于絕大多數(shù)昆蟲及軟體生物樣本的顯微CT前處理。    

儀器推薦：Leica EM CPD300        
全自動操作，溫控精準，樣本放進去就不用管了，簡直是實驗室的“干燥神器”！
   
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