基于經(jīng)皮水分流失測量的本維莫德抑制特應(yīng)性皮炎小鼠屏障功能研究進展
2024年7月，Takatsuki藥物研究中心實驗室Toshiki研究團隊，在《BPB Reports》期刊發(fā)表了題為“Tapinarof, a Novel Topical Therapeutic Aryl Hydrocarbon Receptor Agonist, Suppresses Atopic Dermatitis-like Skin Inflammation in Mice”的研究論文。該研究圍繞非甾體小分子芳香烴受體（AhR）激動劑本維莫德展開，探究了其藥理特性，以及在2,4-二硝基氟苯（DNFB）誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎（AD）樣皮膚炎癥小鼠模型中的應(yīng)用效果。
摘要
本維莫德是一種非甾體類小分子芳香烴受體（AhR）激動劑，目前正被研發(fā)用于特應(yīng)性皮炎（AD）。特應(yīng)性皮炎是由2型輔助性T（Th2）細胞介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，其特征為表皮分化受損和皮膚屏障功能障礙。有研究表明，本維莫德可通過激活芳香烴受體調(diào)控靶基因表達，改善皮膚屏障功能并發(fā)揮抗氧化作用。本研究探討了本維莫德的藥理特性，以及其在2,4-二硝基氟苯誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎樣皮膚炎癥小鼠中的療效。在經(jīng)T細胞激活劑刺激的人外周血單個核細胞中，本維莫德可誘導(dǎo)芳香烴受體激活的標志物細胞色素P4501A1（CYP1A1）的mRNA表達，也能誘導(dǎo)抗氧化酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸：醌氧化還原酶（NQO1）的mRNA表達，同時抑制Th2細胞因子白細胞介素-4（IL-4）的產(chǎn)生。在特應(yīng)性皮炎樣皮炎小鼠中，局部應(yīng)用本維莫德可促進皮膚中Cyp1a1和Nqo1的表達，抑制IL-4的產(chǎn)生、耳廓腫脹及組織病理學(xué)改變，還能抑制作為皮膚屏障功能指標的經(jīng)皮水分流失（TEWL）升高。這些結(jié)果表明，本維莫德可抑制特應(yīng)性皮炎樣皮膚炎癥，其作用機制可能涉及抗氧化、抑制Th2細胞因子產(chǎn)生以及改善皮膚屏障功能等多種藥理作用。
實驗材料與儀器
實驗材料
1. 化合物：本維莫德、他克莫司一水合物、二甲基亞砜（DMSO）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素G、鏈霉素；Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28；佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯；植物血凝素-L
2. 細胞：冷凍保存的人外周血單個核細胞
3. 實驗動物：6周齡雌性BALB/c小鼠
使用儀器
數(shù)字測厚儀、ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、實時熒光定量PCR系統(tǒng)、光學(xué)顯微鏡（用于組織病理切片觀察）
實驗過程
本研究分為體外人外周血單個核細胞實驗和體內(nèi)DNFB誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮炎模型實驗兩部分，同時結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、組織病理學(xué)檢查及相應(yīng)統(tǒng)計學(xué)分析，具體過程如下：
體外人外周血單個核細胞（PBMCs）實驗
1. 復(fù)蘇凍存的人PBMCs，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，以2×10⁵個細胞/孔接種于96孔板，加入2.0×10⁴個磁珠/孔的CD3/CD28 T細胞激活劑刺激2天，再加入不同濃度本維莫德繼續(xù)培養(yǎng)24小時，后續(xù)用RNeasy Mini Kit提取總RNA，通過RT-qPCR檢測CYP1A1和NQO1的mRNA表達。
2. 以相同方式接種PBMCs，加入PMA和PHA-L刺激，同時加入不同濃度的本維莫德，培養(yǎng)48小時后收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測IL-4水平；通過CellTiter-Glo 2.0 Assay檢測細胞活力。
實驗動物飼養(yǎng)與模型構(gòu)建
1. 6周齡雌性BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。
2. 采用DNFB誘導(dǎo)小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮炎：將25 μL 0.15% DNFB（丙酮/橄欖油3:1溶解）涂抹于小鼠左耳雙側(cè)，每3-4天一次，共15天內(nèi)涂抹5次，構(gòu)建半抗原誘導(dǎo)的慢性皮炎模型。
體內(nèi)小鼠給藥與指標檢測
1. 給藥方式：從首次DNFB涂抹當(dāng)天開始，每日一次將20 μL/只的賦形劑（乙醇）、不同濃度本維莫德（0.01%、0.1%、1%）或0.1%他克莫司涂抹于小鼠左耳雙側(cè)，持續(xù)給藥15天。
2. 耳廓腫脹檢測：在第1、2、8、9、15、16天用數(shù)字測厚儀測量小鼠左耳厚度，計算與基線的差值，作為耳廓腫脹指標。
3. 經(jīng)皮水分流失（TEWL）檢測：第16天測量耳廓厚度后，用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀檢測小鼠耳部皮膚的TEWL，評估皮膚屏障功能。
ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀
小鼠耳部皮膚的TEWL
4. 樣本收集與檢測：第16天檢測完成后，麻醉并處死小鼠，取左耳分為三部分，分別用于基因表達、細胞因子檢測和組織病理學(xué)評估。
組織病理學(xué)檢查標準
對HE染色的耳部切片中心區(qū)域進行光學(xué)顯微鏡觀察，從真皮炎癥細胞浸潤、表皮角化過度、痂皮形成三個維度，按“-（無）、±（極輕微）、+（輕微）、2+（中度）、3+（重度）”的標準進行分級評分。
實驗結(jié)論
1. 本維莫德可在人外周血單個核細胞中激活芳香烴受體（AhR）通路，顯著上調(diào)CYP1A1和抗氧化基因NQO1的mRNA表達，同時以濃度依賴的方式抑制Th2細胞因子IL-4的產(chǎn)生，表明其在體外具有抗氧化和抑制Th2細胞活化的作用。
2. 在DNFB誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮炎模型中，局部應(yīng)用0.01%及以上濃度的本維莫德可抑制小鼠耳廓腫脹，降低經(jīng)皮水分流失（TEWL），改善皮膚屏障功能，且效果與陽性藥0.1%他克莫司相當(dāng)。
3. 組織病理學(xué)結(jié)果顯示，本維莫德可劑量依賴性地減輕小鼠耳部皮膚的真皮炎癥細胞浸潤、表皮角化過度和痂皮形成等病理改變，緩解特應(yīng)性皮炎樣皮膚炎癥。
4. 本維莫德可在小鼠病變皮膚中激活A(yù)hR通路，上調(diào)Cyp1a1和Nqo1的mRNA表達，同時抑制耳部組織中IL-4的升高，提示其通過激活A(yù)hR通路發(fā)揮抗Th2炎癥、抗氧化作用，這是其抑制特應(yīng)性皮炎樣炎癥的重要機制。
5. 特應(yīng)性皮炎患者皮膚中CYP1A1表達降低、AhR表達升高，而低濃度（0.01%）本維莫德即可將小鼠病變皮膚中Cyp1a1和Nqo1的表達恢復(fù)至正常水平，說明低劑量局部應(yīng)用本維莫德即可在皮膚組織中達到有效濃度，發(fā)揮作用。
6. 本維莫德的藥理作用與現(xiàn)有糖皮質(zhì)激素、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑等特應(yīng)性皮炎藥物不同，其兼具改善皮膚屏障功能、抗氧化和抑制2型炎癥的作用，尤其適用于對現(xiàn)有藥物無應(yīng)答或應(yīng)答不佳的患者。
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