優(yōu)化細(xì)胞實驗：讓異質(zhì)細(xì)胞樣本數(shù)據(jù)更可靠的方法
Cell-based assays（CBA）為獲取復(fù)雜且與生物學(xué)相關(guān)的數(shù)據(jù)鋪平了道路。它們可用于量化復(fù)合物的細(xì)胞毒性、生化機制、生物活性和非靶標(biāo)相互作用——在某些情況下甚至可以同時進(jìn)行。然而，CBA的巨大潛力可能需要更多的實驗計劃和準(zhǔn)備工作。在測量CBA時，通常會有一些額外的考慮，而傳統(tǒng)的生化檢測則不會遇到這些問題。這些考慮可能包括檢測實施和評估方面的差異。本文將重點介紹CBA中可能面臨的一些障礙，并提出一些克服障礙的方法。
圖1：微孔板中的貼壁細(xì)胞代表異質(zhì)性樣本。使用BMG LABTECH的Atmospheric Control Unit（ACU）時，除了可用的溫度控制外，您還可以控制讀數(shù)器內(nèi)的CO₂和O₂氣體濃度。這可以將您的酶標(biāo)儀轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞培養(yǎng)箱，并可以在保持細(xì)胞活力的前提下進(jìn)行為期幾天的活細(xì)胞動力學(xué)實驗，從而使基于細(xì)胞的實驗結(jié)果更具生理學(xué)意義。
在本文中，我們將仔細(xì)研究基于細(xì)胞的檢測的異質(zhì)性。我們將強調(diào)許多細(xì)胞樣本的異質(zhì)性所帶來的問題，并提供一些潛在的解決方案和工具。大多數(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)物在進(jìn)行微孔板讀數(shù)時都是異質(zhì)性樣本，不過也有一些基于細(xì)胞的檢測方法，如 alamarBlue™ 或 CellTiter-Glo® ，上清液中的染料是均一的。如圖1所示，貼壁細(xì)胞只能形成薄薄的一層。在異質(zhì)CBA中測量細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)或細(xì)胞膜上的靶標(biāo)時，與均質(zhì)液體樣本相比，需要考慮更多因素。
焦距高度
最佳焦距是指酶標(biāo)儀可以探測樣品最高信號強度的平面。如果測量樣品時焦距不當(dāng)，會對數(shù)據(jù)質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。大多數(shù)體外細(xì)胞模型都依賴于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞通常在微孔板孔的平面底部培養(yǎng)。為了便于細(xì)胞附著，微孔板材料通常經(jīng)過處理，使其表面生成極性基團，或者涂覆細(xì)胞天然細(xì)胞外基質(zhì)的成分。細(xì)胞單層的探測存在一個問題：酶標(biāo)儀上的探測高度必須與樣品的焦平面對齊，以提供最大的信號。BMG LABTECH軟件會自動生成焦距高度曲線，以圖形方式顯示不同焦距下的信號強度（圖2）。如圖所示，如果焦距偏離最佳焦距哪怕只有一毫米，熒光強度就會迅速下降。
圖2：讀數(shù)器控制軟件提供的不同焦距高度下的信號強度曲線。另一方面，當(dāng)探測的焦平面過多地進(jìn)入細(xì)胞上方的溶液時，信噪比（S/B）才會降低（圖3）。在無法確定的情況下，建議使用較低的焦距高度，而不是較高的焦距高度。在BMG LABTECH酶標(biāo)儀上，當(dāng)從微孔板上方或下方讀取時，焦距可以調(diào)整和優(yōu)化，這意味著用戶可始終受益于使用最佳焦距所帶來的檢測質(zhì)量的提高。
圖3：信噪比（S/B）取決于所使用的焦距高度。通過底部光學(xué)器件在不同焦距高度下測量孔，并從不同焦距高度的熒光信號強度中計算S/B。在開始測量前，建議先進(jìn)行焦距調(diào)整。理想情況下，在細(xì)胞數(shù)量多且預(yù)期信號高的孔中進(jìn)行焦距調(diào)整。如果您知道信號強度和S/B比通常較低，請在測量前額外接種一個孔，并用PBS覆蓋，以最大限度地提高可用的S/B比。使用該孔進(jìn)行焦距調(diào)整。
由于貼壁細(xì)胞位于微孔板的底部，因此焦距的最佳值應(yīng)在0至3毫米之間。單個焦距取決于所使用的微孔板及其底層的厚度。
孔掃描的重要性
貼壁細(xì)胞除了在培養(yǎng)基的 Z 平面上有明顯的分布外，通常在 X/Y 平面上也有不同的分布。如果只從中間進(jìn)行測量，結(jié)果可能會嚴(yán)重失真。細(xì)胞可以分布在培養(yǎng)基底的任何位置，而且在大多數(shù)情況下分布不均。特別是在細(xì)胞密度較低或只有亞群包含目標(biāo)時，很可能整個孔的細(xì)胞信號通路分布不均。通常情況下，微孔板測量是在每個孔的中心進(jìn)行的。
在 BMG LABTECH 微孔板酶標(biāo)儀上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)熒光測量時，每孔中心會有 20 次閃爍，然后讀取相應(yīng)的發(fā)射值。結(jié)果為這 20 個測量點的平均值。細(xì)胞可能不會均勻分布在孔表面。例如，它們可能并不集中在孔的中心，而在邊緣沉積。如果只從中間測量熒光表達(dá)細(xì)胞，結(jié)果可能會嚴(yán)重失真。為了解決這個問題，BMG LABTECH 為其酶標(biāo)儀提供了不同的孔掃描選項。除了在孔中心進(jìn)行傳統(tǒng)的測量外，還可將單個測量點以軌道或螺旋掃描模式遍布整個孔底 (圖 4)
圖4：BMG LABTECH的孔掃描選項包括軌道、螺旋和矩陣掃描以及中心測量。這樣，整個孔表面可以覆蓋多個測量點，從而獲得更可靠、更具代表性的測量結(jié)果，并提高重復(fù)測量之間的可再現(xiàn)性。此外，矩陣掃描選項可根據(jù)數(shù)據(jù)點矩陣對每個孔進(jìn)行多次測量。這提供了整個孔內(nèi)信號的局部分辨率，從而提供了監(jiān)測接種均勻性和目標(biāo)信號局部變化的機會。使用矩陣掃描選項時，讀數(shù)器在每個孔中進(jìn)行多次測量，分辨率高達(dá)900點/孔（30 x 30數(shù)據(jù)點矩陣）。BMG LABTECH的軟件可以以圖形方式顯示每個掃描點，為每個孔創(chuàng)建3D熱圖。
如果細(xì)胞密集且分布均勻，則中間讀取和掃描選項都能獲得相似的結(jié)果。然而，如果樣品不均勻，則可以使用掃描選項來補償孔內(nèi)的任何變化。圖 5 顯示了表達(dá)綠色熒光蛋白 (GFP) 的苔蘚細(xì)胞的矩陣掃描。該掃描顯示了孔內(nèi)信號或細(xì)胞的異質(zhì)分布，如果只在孔中心進(jìn)行測量，則無法檢測到這種異質(zhì)分布。矩陣掃描功能還能讓您從評估中排除單個點或整個區(qū)域。
圖5：使用25 x 25矩陣掃描和底部光學(xué)元件獲得的GFP表達(dá)苔蘚細(xì)胞的矩陣掃描。顏色表示信號強度，從低（紫色和藍(lán)色）到高（紅色）。圖6顯示了使用孔中心和掃描選項測量的10個重復(fù)。當(dāng)使用所有掃描選項時，變異系數(shù)（以%CV表示）會大大降低，而矩陣掃描可獲得最佳結(jié)果。由于螺旋平均法可以覆蓋更大的孔區(qū)，因此與軌道平均法相比，數(shù)據(jù)會略有改善。
圖6：孔掃描可降低數(shù)據(jù)變異系數(shù)（%CV）。使用底部光學(xué)器件和不同的孔掃描選項測量細(xì)胞。每個掃描選項均顯示孔中心測量數(shù)據(jù)的變異系數(shù)（%CV）降低。結(jié)論
異質(zhì)細(xì)胞樣品的熒光測量主要建議總結(jié)如下：
- 處理貼壁細(xì)胞時一定要調(diào)整焦距。
- 貼壁CBA通常受益于孔掃描模式的應(yīng)用，以校正孔中異質(zhì)信號分布。
- 矩陣掃描功能可讓您獲得整個孔內(nèi)信號的局部分辨率，從而有機會監(jiān)測接種的均勻性和目標(biāo)信號的局部變化。
- 矩陣掃描功能還使您能夠從評估中排除單個點或整個區(qū)域。
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