Cytation1 高通量活細胞自噬體定量分析新方案
自噬 (Autophagy) 作為細胞內(nèi)源性保護機制，通過溶酶體途徑降解并回收自身受損細胞器及錯誤折疊蛋白，其動態(tài)調(diào)控研究對癌癥、神經(jīng)退行性疾病及代謝綜合征等重大疾病機制解析具有關鍵意義。目前體外模型評價自噬的檢測手段包括電子顯微鏡、Western Bolt、構(gòu)建 GFP-LC3 熒光報告蛋白的細胞株等方法，但是這些方法或為終點法檢測、或需要較復雜的實驗操作或者只適合特定細胞系�；诖�，來自德國團隊開發(fā)了一套基于 Cyto-ID® 染色 +Cytation 成像的絕對定量方案，輕松實現(xiàn)活細胞自噬體評價。
方案主要特點
主要檢測原理
使用 780-1400 nm 的紅外光線輻照加熱細胞至 39℃，誘導細胞產(chǎn)生自噬反應，CYTO-ID 自噬檢測試劑盒的綠色染料能夠特異性標記前自噬體、自噬體和自噬溶酶體，同時包含用于細胞核染色的 Hoechst 染料，以便能夠清晰定位每個細胞。通過加自噬體降解抑制劑氯喹作為陽性對照。細胞標記后，通過熒光成像定量分析每個細胞的自噬體含量。
主要實驗流程
1. 細胞準備
2.1 分組處理：
設備：安捷倫 BioTek Cytation 1 細胞成像多功能微孔板檢測儀 （備注：該方案兼容 Cytation 系列所有設備）
成像設置：20X 物鏡下雙通道捕獲（DAPI 核信號+GFP 自噬體信號），每孔取 2 張中心區(qū)域圖像。
圖像處理：包括圖像去背景、去卷積處理，以獲得良好的用于分析的圖像
圖像分析：Primary Mask:識別細胞核（DAPI 信號）。Secondary Mask: 使用 Spot Count 功能統(tǒng)計核周自噬體數(shù)量（GFP 信號）。如下圖所示圖像處理后（A），在細胞核周圍設置預定義的 mask（B1-B2）。軟件自動統(tǒng)計 Mask 識別的每個細胞內(nèi)的自噬體數(shù)量（B2）。
總結(jié)：為什么要選擇這套流程？
標準化：該方案提供了從細胞處理到數(shù)據(jù)分析全流程 SOP。
兼容性：可搭配 Cytation 的微孔板檢測系統(tǒng)拓展多重檢測（如細胞活力、ROS、線粒體膜電位等）。
應用潛力：目前此方案已應用于 ME/CFS 患者細胞研究，助力個性化熱療方案開發(fā)。
參考文獻
Hochecker, B. et al. (2024). Quantification of Autophagosomes in Human Fibroblasts Using Cyto-ID® Staining and Cytation Imaging. Bio-protocol 14(13): e5025. DOI: 10.21769/BioProtoc.5025.
相關產(chǎn)品：
Cytation 1 細胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)
關于安捷倫細胞分析
安捷倫細胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細胞分析儀、NovoCyte系列流式細胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細胞分析平臺聚焦基礎科研與細胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強大分析工具，提供多方位的細胞效力檢測和深度的細胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發(fā)。
方案主要特點
- 活細胞中自噬小體的絕對定量
- 用于測定原代人皮膚成纖維細胞自噬的優(yōu)化方案
- 可測試活性物質(zhì)及治療手段對自噬的影響
- 基于自動化成像技術的自噬測定方法
圖：該方案主要的實驗流程圖
主要檢測原理
使用 780-1400 nm 的紅外光線輻照加熱細胞至 39℃，誘導細胞產(chǎn)生自噬反應，CYTO-ID 自噬檢測試劑盒的綠色染料能夠特異性標記前自噬體、自噬體和自噬溶酶體，同時包含用于細胞核染色的 Hoechst 染料，以便能夠清晰定位每個細胞。通過加自噬體降解抑制劑氯喹作為陽性對照。細胞標記后，通過熒光成像定量分析每個細胞的自噬體含量。
主要實驗流程
1. 細胞準備
- 使用原代人皮膚成纖維細胞（8 歲健康男性包皮來源，傳代 8-9 次）
- 解凍 5×10⁶ 細胞，500×g 離解凍 0.5×10⁶ 細胞，離心后接種至 T175 瓶，培養(yǎng) ≥48 小時恢復狀態(tài)
- 96 孔板每孔接種 5,000 細胞（100 μL DMEM），靜置 1 小時使均勻貼壁，培養(yǎng) 24 小時。
2.1 分組處理：
- 對照組：6 孔加普通 DMEM，6 孔加 0.5 μM 氯喹（陽性對照）。
- 熱療組：同法分組，采用 IRAcubator（39℃ 紅外-A 輻射，780-1400 nm）39℃ 處理 1 小時（對照組同步 37℃ 培養(yǎng)）。
- 注意：氯喹處理時間嚴格控制在 1 小時內(nèi)。
- 棄上清，用 1× assay buffer 輕柔洗滌 2 次。
- 加入 100 μL 染色液（含 CYTO-ID® 綠染劑 +Hoechst 核染），避光孵育 30 分鐘。
- 再次洗滌后，加 100 μL assay buffer 立即成像。
設備：安捷倫 BioTek Cytation 1 細胞成像多功能微孔板檢測儀 （備注：該方案兼容 Cytation 系列所有設備）
圖像處理：包括圖像去背景、去卷積處理，以獲得良好的用于分析的圖像
圖像分析：Primary Mask:識別細胞核（DAPI 信號）。Secondary Mask: 使用 Spot Count 功能統(tǒng)計核周自噬體數(shù)量（GFP 信號）。如下圖所示圖像處理后（A），在細胞核周圍設置預定義的 mask（B1-B2）。軟件自動統(tǒng)計 Mask 識別的每個細胞內(nèi)的自噬體數(shù)量（B2）。
總結(jié)：為什么要選擇這套流程？
標準化：該方案提供了從細胞處理到數(shù)據(jù)分析全流程 SOP。
- ✦絕對定量：自動化的成像方案保證在一致的成像條件下進行樣本的定量分析，直接計算“自噬體/細胞核”數(shù)量，告別 Western Blot 的半定量模糊性。
- ✦活細胞友好：無需固定或裂解細胞，保持生理狀態(tài)。
- ✦高通量：96 孔板設計，1 小時內(nèi)完成多組平行檢測，適合高通量篩選。
- ✦適配性強：可擴展至其他治療（如藥物篩選）或細胞類型（如 HeLa）。
- ✦低成本：相比其他復雜制樣過程，該方案從染色到分析僅需兩小時，且無需昂貴抗體或特殊耗材。
兼容性：可搭配 Cytation 的微孔板檢測系統(tǒng)拓展多重檢測（如細胞活力、ROS、線粒體膜電位等）。
應用潛力：目前此方案已應用于 ME/CFS 患者細胞研究，助力個性化熱療方案開發(fā)。
Cytation 系列檢測平臺能夠提供多種靈活通量的標準化細胞篩選檢測方案
參考文獻
Hochecker, B. et al. (2024). Quantification of Autophagosomes in Human Fibroblasts Using Cyto-ID® Staining and Cytation Imaging. Bio-protocol 14(13): e5025. DOI: 10.21769/BioProtoc.5025.
相關產(chǎn)品：
Cytation 1 細胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)
關于安捷倫細胞分析
安捷倫細胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細胞分析儀、NovoCyte系列流式細胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細胞分析平臺聚焦基礎科研與細胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強大分析工具，提供多方位的細胞效力檢測和深度的細胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發(fā)。
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