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細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在單細(xì)胞測序中進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)和樣品質(zhì)量驗(yàn)證的應(yīng)用優(yōu)勢
利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在單細(xì)胞測序中評估細(xì)胞
概述單細(xì)胞測序技術(shù)能夠用來表征異常細(xì)胞群，分析稀有細(xì)胞和細(xì)胞圖譜網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性等。由于單細(xì)胞測序巨大的應(yīng)用潛力，目前此技術(shù)正在經(jīng)歷爆炸性增長。然而，單細(xì)胞測序需要成本和時(shí)間的大量投資。為了確保時(shí)間和資源的投資得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)回報(bào)，處理前的樣本質(zhì)量至關(guān)重要。此外，由于所有的單細(xì)胞測序方案都依賴于在處理前準(zhǔn)確定量細(xì)胞，因此準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)是非常重要的第一步。
因此，用于定量單細(xì)胞測序樣品的自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀必須準(zhǔn)確可靠地對所有樣品類型的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，包括分離的組織、分離的細(xì)胞核、全血和培養(yǎng)的細(xì)胞系。在此，我們演示了LUNA-FX7自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀如何為不同類型的樣品提供準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)和樣品質(zhì)量的驗(yàn)證。
單細(xì)胞測序工作流程：1) 組織收集，2) 分離細(xì)胞制備，3) 測序文庫制備，4) 測序和 5) 分析。
細(xì)胞樣本質(zhì)量評估
最初收集了兩個(gè)細(xì)胞樣本用于單細(xì)胞測序分析。兩個(gè)樣本均使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞活力方案和AO/PI細(xì)胞染色染料進(jìn)行計(jì)數(shù)。第一個(gè)樣品是從人外周血中分離出的B細(xì)胞，具有高度的活力和單細(xì)胞分離度，適合下游文庫制備。
B細(xì)胞為單細(xì)胞文庫做好了充分準(zhǔn)備，包括所有陽性綠色細(xì)胞，沒有死細(xì)胞（RF）或顆粒碎片(BF)，具有100%活力。這些健康細(xì)胞的平均大小為10.7 μm，在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)濃度為3.00E+05個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞簇圖中的單細(xì)胞分離率為100%。
相比之下，第二個(gè)樣品（貼壁AsPC-1細(xì)胞）提供了一個(gè)示例，說明基于圖像的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)器對于評估樣品制備的數(shù)量和質(zhì)量至關(guān)重要。收獲后，AsPC-1細(xì)胞發(fā)生不完全解離。生成的圖像清楚地顯示，很大一部分細(xì)胞內(nèi)容物仍被納入結(jié)合的簇中，高達(dá)9%，而AsPC-1的活力僅為56%。根據(jù)活力和細(xì)胞分離情況，該樣品不適合下游處理。在許多情況下，單細(xì)胞的樣品細(xì)胞是有限的，需要低細(xì)胞濃度和重復(fù)計(jì)數(shù)才能獲得最佳和快速的細(xì)胞計(jì)數(shù)。在低細(xì)胞濃度的精確計(jì)數(shù)中，我們使用LUNA 1通道載玻片，它可以容納更大的細(xì)胞體積，即使細(xì)胞濃度低至1.00E+04個(gè)細(xì)胞/ml也可以進(jìn)行計(jì)數(shù)。
用于單細(xì)胞測序的細(xì)胞樣品制備不充分的示例。“失敗的“AsPC-1細(xì)胞制備顯示死細(xì)胞含量高且含有不完全解離的細(xì)胞簇。LUNA-FX7的簇直方圖功能可以準(zhǔn)確評估細(xì)胞簇百分比與分離細(xì)胞的百分比。
分析完整的細(xì)胞核
對于一些單細(xì)胞測序應(yīng)用，分離的細(xì)胞需要進(jìn)一步處理以產(chǎn)生分離且完整的細(xì)胞核。接下來我們評估了LUNA-FX7的實(shí)用性，以評估完全分離的細(xì)胞核的整體質(zhì)量和數(shù)量。為此，我們使用了3種細(xì)胞系-HL60、HeLa細(xì)胞和HEK細(xì)胞。下圖顯示了包含完整健康HL60細(xì)胞（左）、細(xì)胞核部分分離的HL60細(xì)胞（中）和細(xì)胞核完全分離（右）的3幅圖像，并且具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞通過AO染色后呈現(xiàn)綠色熒光。相比之下，死細(xì)胞和分離的細(xì)胞核都因通過缺損或缺失的細(xì)胞膜吸收PI而呈現(xiàn)紅色熒光。然而，LUNA-FX7允許您使用大小信息區(qū)分完整的死細(xì)胞和完整的細(xì)胞核。例如，完整活體的HL-60的平均細(xì)胞大小為13.4微米，完全分離的細(xì)胞核的平均大小為8.3微米，表明細(xì)胞膜和血漿部分被成功去除。未完全分離的核尺寸經(jīng)測量平均為10.2 μm，表明分離核的質(zhì)量不足以進(jìn)行下游處理。
HL 60細(xì)胞的細(xì)胞核分離過程的可能結(jié)果。明場(BF)圖像和帶標(biāo)簽的疊加熒光圖像可讓您輕松區(qū)分不同的細(xì)胞“狀態(tài)”。在BF圖像中，完整的細(xì)胞明顯比分離的細(xì)胞核更突出、更暗。同時(shí)，熒光圖像和計(jì)數(shù)可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量評估。
此外，LUNA-FX7的高分辨率明場圖像可用于目視驗(yàn)證分離核的質(zhì)量。例如，分離的細(xì)胞核可以很容易地與完整細(xì)胞區(qū)分開來，因?yàn)榧?xì)胞核的邊界更薄，并且由于缺乏細(xì)胞膜而不明顯。
區(qū)分活核、死核和完整核。由于死細(xì)胞和完整的細(xì)胞核都缺乏完整的細(xì)胞膜，因此從碘化丙啶染色中可以看到紅色熒光。LUNA-FX7生成的BF圖像和尺寸測量可以常規(guī)地區(qū)分死細(xì)胞和完整的分離細(xì)胞核。
總之，LUNA-FX7在三通道成像（BF、GF和RF）方面的功能和靈敏度，以及復(fù)雜的標(biāo)記算法，使您可以在進(jìn)行昂貴的下游處理之前建立樣品通過與否的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
評估分離的核和可能的結(jié)果。明場(BF)圖像和疊加熒光圖像可讓您輕松區(qū)分不同的細(xì)胞“狀態(tài)”。在BF 圖像中，完整的細(xì)胞比孤立的細(xì)胞核顯得明顯更突出、邊界更暗。同時(shí)，熒光圖像和計(jì)數(shù)可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量評估�；畹耐暾�(xì)胞用吖啶橙(GF)染色，分離的細(xì)胞核被染成紅色。LUNA-FX7可以準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)胞質(zhì)大、細(xì)胞核小(HeLa)的樣品以及細(xì)胞核相對于細(xì)胞質(zhì)較大的細(xì)胞類型(HEK293)。
結(jié)論
對于單細(xì)胞測序，LUNA-FX7為探索提高細(xì)胞樣本準(zhǔn)確性和可靠性的研究人員提供了見解，以評估各種樣本類型中的細(xì)胞和分離的細(xì)胞核樣本的數(shù)量和質(zhì)量。
點(diǎn)成生物細(xì)胞計(jì)數(shù)解決方案
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標(biāo)簽：
細(xì)胞計(jì)數(shù)儀
單細(xì)胞測序
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