Cytation 多模式平臺(tái)在光敏劑抗氧化活性檢測(cè)中的新應(yīng)用
AOP1 光激活細(xì)胞系統(tǒng)技術(shù)用于天然抗氧化物篩選
自然界賦予了植物豐富的抗氧化資源，長(zhǎng)久以來，學(xué)術(shù)界及工業(yè)界都在不懈地從這些綠色寶藏中尋找能夠?qū)棺杂苫鶕p傷、延緩衰老甚至治療疾病的“圣杯”。然而，大多數(shù)現(xiàn)有的評(píng)價(jià)體系基于試管內(nèi)生化水平的檢測(cè)，無法準(zhǔn)確反映活體或者活細(xì)胞條件下抗氧化劑的真實(shí)效能。目前唯一在細(xì)胞模型上使用的 ROS 生物傳感器是二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），但是使用該方法也有很多局限性，比如無法區(qū)分抗氧化性和細(xì)胞毒性等；而采用全新AOP1光激活細(xì)胞系統(tǒng)（Light Up cell System，LUCS）技術(shù)，能夠很好的彌補(bǔ)這一缺憾，在活細(xì)胞水平精細(xì)檢測(cè)ROS的產(chǎn)生。
什么是 AOP1 技術(shù)
AOP1 檢測(cè)方法基于一種光激活光敏劑噻唑橙（Thiazole orange，TO），它能夠釋放與細(xì)胞產(chǎn)生的 ROS 的實(shí)際濃度相關(guān)的信號(hào)。檢測(cè)原理如下圖 1 所示：1) 光誘導(dǎo)前，噻唑橙（TO）加入細(xì)胞后被外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白排出細(xì)胞；2) 光照下，TO將能量轉(zhuǎn)移給三重態(tài)的分子氧，生成單線態(tài)氧和自由基（ROS）；3) ROS改變TO的外排和其他細(xì)胞功能；4) TO進(jìn)入細(xì)胞核后增加熒光發(fā)射信號(hào)強(qiáng)度。加入抗氧化劑后，抗氧化劑抑制ROS的產(chǎn)生， 保持TO在細(xì)胞外從而降低熒光信號(hào)，通過這個(gè)原理可以用于篩選評(píng)價(jià)抗氧化藥物的作用效果。
自然界賦予了植物豐富的抗氧化資源，長(zhǎng)久以來，學(xué)術(shù)界及工業(yè)界都在不懈地從這些綠色寶藏中尋找能夠?qū)棺杂苫鶕p傷、延緩衰老甚至治療疾病的“圣杯”。然而，大多數(shù)現(xiàn)有的評(píng)價(jià)體系基于試管內(nèi)生化水平的檢測(cè)，無法準(zhǔn)確反映活體或者活細(xì)胞條件下抗氧化劑的真實(shí)效能。目前唯一在細(xì)胞模型上使用的 ROS 生物傳感器是二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），但是使用該方法也有很多局限性，比如無法區(qū)分抗氧化性和細(xì)胞毒性等；而采用全新AOP1光激活細(xì)胞系統(tǒng)（Light Up cell System，LUCS）技術(shù)，能夠很好的彌補(bǔ)這一缺憾，在活細(xì)胞水平精細(xì)檢測(cè)ROS的產(chǎn)生。
什么是 AOP1 技術(shù)
AOP1 檢測(cè)方法基于一種光激活光敏劑噻唑橙（Thiazole orange，TO），它能夠釋放與細(xì)胞產(chǎn)生的 ROS 的實(shí)際濃度相關(guān)的信號(hào)。檢測(cè)原理如下圖 1 所示：1) 光誘導(dǎo)前，噻唑橙（TO）加入細(xì)胞后被外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白排出細(xì)胞；2) 光照下，TO將能量轉(zhuǎn)移給三重態(tài)的分子氧，生成單線態(tài)氧和自由基（ROS）；3) ROS改變TO的外排和其他細(xì)胞功能；4) TO進(jìn)入細(xì)胞核后增加熒光發(fā)射信號(hào)強(qiáng)度。加入抗氧化劑后，抗氧化劑抑制ROS的產(chǎn)生， 保持TO在細(xì)胞外從而降低熒光信號(hào)，通過這個(gè)原理可以用于篩選評(píng)價(jià)抗氧化藥物的作用效果。
圖1：AOP1檢測(cè)原理示意圖
如何開展AOP1的檢測(cè)？
對(duì)于光敏劑的檢測(cè)，傳統(tǒng)的方法，需要外部光源提供持續(xù)高能光照閃爍以實(shí)現(xiàn)光誘導(dǎo)，并沒有合適的設(shè)別開展針對(duì)光敏劑的微孔板體系的高通量檢測(cè)，而安捷倫 BioTek Cytation 5 多模式細(xì)胞成像系統(tǒng)具有獨(dú)特的顯微成像和微孔板讀數(shù)雙平臺(tái)，可以在一臺(tái)設(shè)備內(nèi)為微孔板樣品提供基于 LED 燈的光源照射，以及基于高能氙燈的熒光強(qiáng)度檢測(cè)。正因?yàn)檫@樣靈巧的設(shè)計(jì)，能夠以“即插即用”模式實(shí)現(xiàn)便捷的 AOP1 高通量檢測(cè)（圖 2）。
圖 2：Cytation 系列產(chǎn)品的巧妙設(shè)計(jì)用于支持 AOP1 檢測(cè)
AOP1 活細(xì)胞水平評(píng)價(jià)抗氧化物活性案例
我們用一個(gè)小案例來展示使用 Cytation 多模式平臺(tái)開展活細(xì)胞水平的抗氧化活性評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)采用 HepG2 細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞在 37 °C、5% CO2下培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)移到 96 孔微孔板中。試驗(yàn)方案中加入不同濃度的槲皮素（1.95 至 500 微摩爾）藥物處理 4 小時(shí)后，將 AOP1 檢測(cè)試劑盒（編號(hào) K-1001，來自 Anti Oxidant Power）的溶液 A 添加到待測(cè)樣本孔中，在 37 ℃，5% CO2中孵育 30 分鐘。孵育后，采用 Cytation5 平臺(tái)的兩步法，每 2 分鐘動(dòng)態(tài)測(cè)量一次 AOP1 的熒光信號(hào)強(qiáng)度。
Cytation5 & Gen5 設(shè)置 AOP1 檢測(cè)程序
Gen5 軟件采用 Agilent BioTek 特有的 StepWise 程序編輯流程，能夠靈活的將多功能微孔板檢測(cè)步驟和熒光顯微成像步驟組合在一次實(shí)驗(yàn)程序設(shè)置中，正由于這個(gè)優(yōu)勢(shì)，可以非常便捷的通過兩步法，實(shí)現(xiàn)AOP1的抗氧化能力測(cè)定（圖3）。
Step1:
使用 505 nm 激發(fā)和 535 nm 發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量 AOP1 初始熒光強(qiáng)度
Step2:
設(shè)計(jì)動(dòng)力學(xué)讀數(shù)模塊，立即用 Cytation 5 成像模式的 GFP LED 光源，在強(qiáng)度 1 的條件下照射 500 毫秒。這個(gè)熒光讀數(shù)/照明周期設(shè)置為相同的 18 次重復(fù)，用于獲得動(dòng)力學(xué)讀數(shù)曲線。
如果需要，還可以使用 Cytation5 的無標(biāo)記成像模式對(duì)孔板內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用于結(jié)果的均一化，獲得更可靠的數(shù)據(jù)。
圖 3：Cytation5 & Gen5 AOP1 檢測(cè)流程示意圖
數(shù)據(jù)分析
細(xì)胞抗氧化指數(shù)，Cellular antioxidant index (CAI) 的計(jì)算采用每個(gè)樣品標(biāo)準(zhǔn)化后的動(dòng)力學(xué)曲線積分結(jié)果，計(jì)算公式 CAI = 1000 - (X ∙ 1000) CTL，其中 X 是 X 是標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFU），CTL 是標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照孔的平均值。計(jì)算 CAI 值后，采用非線性回歸模型（Sigmoid 擬合）計(jì)算 EC50 值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
使用 Cytation5 的兩步法 AOP1 檢測(cè)，能夠動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) TO 熒光的變化。這些數(shù)據(jù)可以被標(biāo)準(zhǔn)化，以便更容易地在實(shí)驗(yàn)之間進(jìn)行比較，如圖 4 所示。TO 濃度的輕微差異、細(xì)胞數(shù)量的不同以及細(xì)胞類型的差異都可能導(dǎo)致原始熒光信號(hào)的變化。每次熒光動(dòng)力學(xué)測(cè)定的結(jié)果都?xì)w一化為未處理對(duì)照組最后一次動(dòng)力學(xué)測(cè)定的平均值（假定這是最高的原始信號(hào)），并表示為百分比。這種分析方法可以用于比較不同實(shí)驗(yàn)中對(duì)照樣本與實(shí)驗(yàn)樣本之間 ROS 活性抑制的時(shí)間或程度。
圖 4：將熒光數(shù)據(jù)繪制為時(shí)間的函數(shù)用歸一化積分計(jì)算細(xì)胞抗氧化指數(shù)（CAI）
歸一化后的數(shù)據(jù)可以在測(cè)量后進(jìn)一步分析，通過計(jì)算數(shù)據(jù)曲線下的面積（AUC）或數(shù)據(jù)的積分，可以為每個(gè)處理濃度計(jì)算一個(gè) CAI 值。這些數(shù)據(jù)可以用四參數(shù)擬合確定 EC50 值。圖 5 展示了兩次獨(dú)立的槲皮素EC50值的測(cè)定。
從結(jié)果看，槲皮素的 EC50 值分別在兩塊不同的板上測(cè)定為 15.70 和 15.78 μM，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為 0.996 和 0.994，這些數(shù)據(jù)展示了使用 Cytation 平臺(tái)開展 AOP1 實(shí)驗(yàn)的可靠性和重復(fù)性，這些結(jié)果與先前發(fā)表的數(shù)據(jù)（槲皮素 EC50 = 23.66 μM，R2 = 0.985）一致。
圖5：計(jì)算化合物劑量效應(yīng)曲線，并計(jì)算EC50用于對(duì)比不同化合物的作用效果
Cytation 平臺(tái)開展 AOP1 抗氧化活性評(píng)價(jià)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)：打破傳統(tǒng)，化繁為簡(jiǎn)，性能優(yōu)異，無限拓展
由于 AOP1 檢測(cè)需要高強(qiáng)度的光線來實(shí)現(xiàn)光激活，并且需要?jiǎng)恿W(xué)讀數(shù)檢測(cè)，此前 AOP1 這類光敏劑的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)是使用專門的閃光燈照射器獲得，并且操作起來相當(dāng)繁瑣，每次進(jìn)行光照時(shí)，都需要將微孔板從讀板機(jī)中取出，并手動(dòng)移動(dòng)到光源處。然而，Cytation 系列的巧妙設(shè)計(jì)能夠同時(shí)進(jìn)行顯微熒光成像和傳統(tǒng)的熒光強(qiáng)度檢測(cè)，顯微成像模塊提供了一個(gè)聚焦的、特定波長(zhǎng)的、高能量的光線來激發(fā)熒光分子，開展 AOP1 檢測(cè)時(shí)無需反復(fù)取出樣本，為 AOP1 檢測(cè)提供了全新的方案。
此外 Cytation 系列平臺(tái)支持高通量檢測(cè)，可配置完善的活細(xì)胞檢測(cè)裝置，適用于 96 孔和 384 孔微孔板中的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，適合高通量抗氧化物的篩選方案，其出色的多模式平臺(tái)還可以用于后續(xù)的藥物靶點(diǎn)及毒性評(píng)價(jià)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的開展。
相關(guān)產(chǎn)品：
Cytation 5 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)包括xCELLigence RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測(cè)儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測(cè)和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測(cè)與分析方案開發(fā)。
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